렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

Biology

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Summary

렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

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Zhang, Y., McCulloch, K., Malicki, J. Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants. J. Vis. Exp. (28), e1258, doi:10.3791/1258 (2009).

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Abstract

렌즈는 광학 컵 [1,2]의 개발에 중요한 역할을합니다. 모델 유기체로 zebrafish를 사용하여 렌즈 개발에 관한 질문은 해결할 수 있습니다. zebrafish 작은 크기, 높은 생산력, 짧은 수명주기, 그리고 관리의 용이성 등 여러 가지 유리한 특성에 의한 유전자 연구에 유용합니다. 렌즈 개발 zebrafish에 급속하게 발생합니다. 72 HPF으로 zebrafish 렌즈 기능 성숙이다 [3]. 풍부한 유전 및 분자 자원 zebrafish 연구를 지원하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 척추 동물들에게 zebrafish 눈의 유사성은 인간의 결함이 뛰어난 동물 모델 [4-7]과 같이 사용에 대한 기초를 제공합니다. 여러 zebrafish의 돌연변이가 어떤 경우에는 렌즈 조직의 완전한 변성에 이르게 세포 사망의 높은 수준 [8]. 포함한 렌즈 이상 전시

렌즈 이상은 본질적인 원인이나 주변 조직과 결함이 상호 작용에 의한인지 확인하려면, 야생 형 안구에 돌연변이 렌즈의 이식이 수행됩니다. 를 사용하여 화재를 광택 금속 바늘, 돌연변이 또는 야생 형 렌즈는 신중하게 기증 동물의 해부를하고, 호스트로 전송됩니다. 야생 타입과 돌연변이 조직을 구분하기 위해 유전자 변형 라인은 기증자로 사용됩니다. 이 줄은 렌즈를 포함한 모든 조직의 막 - 바운드 GFP를 표현합니다. 이 이식 기술은 zebrafish 렌즈 돌연변이의 연구에 필수적인 도구입니다.

Protocol

1 부 : 배아 준비

이 프로토콜에서는, 우리는 가상 zebrafish 렌즈 돌연변이 거하고 있음을 나타내는 JJ XY 기호를 사용합니다.

  1. Zebrafish의 변종은 14h light/10h 어두운주기 28.5 C에서 표준 생선 시설 조건에서 유지됩니다.
  2. 저녁에는 자리 남성과 zebrafish 변형 JJ XY의 여성 : AB / TU, 서로를 구분하는 구분선과 탱크에 TG (mGFP). 이 십자가의 자손은 모든 조직에서 GFP의 transgene을 표현되며, 기부자로 사용됩니다. 병렬로, 비 - 유전자 변형 야생 형 동물 사이의 경계를 설정하는 동일한 절차를 사용합니다. 본 실험의 목적에 따라, 한 기증자 또는 호스트로 JJ XY의 로커스에서 야생 타입 동물을 교차 수 있습니다.
  3. 빛이 아침에 켜지 후 한 시간 이내, 친구에게 물고기를 허용하도록 디바이더를 제거합니다.
  4. 15-30분 100 X 15mm 배양 접시에 배아를 수집 후, 그들을 청소하고, 매체 (계란 물)을 변경합니다.
  5. 원하는 시간까지 28.5 C 배양기에서 배아 보관하십시오.
  6. 언제 이식 준비, 날카로운 집게 두 쌍이있는 수동 chorion을 제거하고 30 분 동안 칼슘 무료 ZFR에서 0.2 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 배아를 품어.

2 부 : 절개의 바늘의 작성

  1. 및 기증 렌즈를 이동하고 호스트에 삽입하는 데 사용하는 무딘 바늘, 렌즈 주위 조직을 잘라 chorion을 제거하고, 아가로 오스의 릴리스 배아하는 데 사용됩니다 날카롭게 한 : 이식 절차는 바늘의 두 가지 유형이 필요합니다. 여기이 바늘을 만드는 방법을 보여줍니다.
  2. 첫째, 파스퇴르 피펫의 끝은 다이아몬드 칼을 이용하여 차단해야합니다. 다음 길이의 약 절반 안에되도록 파스퇴르 피펫 팁으로 모세관 유리를 삽입합니다. 이것은 쉽게 다음 단계에서 유리에 그것을 용융하여 텅스텐 와이어를 고정하는 것입니다.
  3. 다음 모세관의 열린 끝을로 얇은 텅스텐 와이어를 삽입합니다. 알콜 램프로 철사 위에 유리를 용융. 손으로 바늘의 다른 쪽 끝을 비틀면서 집게를 사용하여 금속 와이어와 함께 꾸준한 유리 끝을시오. 부드럽게 유리는 금속 주위에 나선 자리에서 재밌해야합니다.
  4. 당신이 뭉툭한 팁 바늘하고있다면이 절차의 마지막입니다. 날카롭게 바늘을 만들려면, 아주 좋은 팁이 생성되도록 금속을 굽기, 1-1.5 분 알콜 램프를 통해 텅스텐 와이어를 잡아. microscropy.It에 의해 팁의 품질은 이식 직전 몇 초 동안 불꽃에 두 바늘을 소독하는 것이 좋습니다 확인하십시오.

파트 3 : 시약의 준비

  1. 칼슘 무료 Zebrafish 링거스 (ZFR) 솔루션 (116 MM NaCl, 2.9 KCl MM, 5 MM HEPES, pH를 7.2)
  2. 칼슘 무료 Zebrafish 링어의 솔루션 (산도 7.2)에서 0.2 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
  3. 칼슘 무료 ZFR에서 1.2 % 아가로 오스 (낮은 융점)
  4. 칼슘 무료 ZFR에서 0.2 % 아가로 오스 (낮은 융점)
  5. 리터 당 배아 매체 (산도 7.0이 포함되어 있습니다 : 10 ML 행크스 솔루션 # 1, 1ml 행크스 솔루션 # 2, 10ml 행크스 솔루션 # 4, 10ml 행크스 솔루션 # 5, 0.35 g의 나트륨 중탄산염, 2M 300 UL을 HCL, 페니실린 - 스트렙토 마이신 500,000 Zebrafish 도서 (오레곤 프레스 대학, 2000)에서와 마찬가지로 U).
  6. 텅스텐 와이어, 도금, 0.1mm 직경 알파 Aesar
  7. 모세관, 1.0mm 직경, 세계 정밀 계측기

4 부 : 이식 절차

  1. 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 물 목욕 40 C에 preheated 칼슘 무료 ZFR에서 1.2 % 낮은 용융 점 아가로 오스를 준비합니다.
  2. 원하는 단계 (30 HPF, 예를 들면)에서, 파스퇴르 피펫으로 배아를 타고 천천히 원심 튜브에 그들을 추방하고, 서서히 원심 튜브에 그들을 추방하고 약 5 초 동안 품어. 기증자와 호스트는 별도 incubated해야합니다.
  3. 피펫으로 원심 튜브에서 1.2 % 아가로 오스의 배아를 가지고 100mm 폴리스티렌 페트리 접시 두 평행 행에서 그들을 마련, 호스트와 기부자는 별도의 유지. 천천히 그리고 신중하게 그들을 pipetting하여, 대부분의 태아는 아가로 오스에서 양쪽에 누워 것입니다. 당신은 아가로 오스가 굳은 전에 안구가 직면되도록 무딘 바늘을 사용하여이 위치에 거짓말하지 않는 사람을 방향해야합니다.
  4. 응고에 1.2 % 아가로 오스 기다립니다, 그리고 0.2 % 낮은 융점 아가로 오스 솔루션을 오버레이.
  5. 날카롭게 바늘을 사용하면, 눈 주위에 아가로 오스를 제거, 그리고 아주 조심스럽게 작은 스트로크를 사용하여 호스트 및 기증 배아에서 렌즈를 잘라. 그럼으로 그것을 찢어하지 않는 렌즈에 그냥 가까운 정도 잘라 있는지 확인뿐만 아니라, 그래서 당신은 호스트 눈의 나머지 부분에서 너무 많은 조직을 제거하지 마십시오.
  6. 일단 무료로 렌즈가 중간에 떠 있습니다. 무딘 바늘을 사용하여 조심스럽게 기증자를 밀어렌즈는 단지 호스트 렌즈가 정상적으로 될 어디의 위치 이상에 다음 무딘 바늘로 눈 안으로 그것을 아래로 밀어. 호스트 렌즈가 삭제됩니다.
  7. 30~60분에 대한 1.2 % 아가로 오스의 기증자와 호스트 배아를 남겨 다음 날카로운 바늘을 사용하여 아가로 오스에서 그들을 출시하고, 배아 매체와 함께 24 잘 판에 그들을 전송합니다. 각각의 배아는 별도의 우물을 점유한다. 제대로 때문에 호스트가 어떤 기증자에 해당하는 취소되는 우물 레이블을해야합니다.
  8. 기증자 파생 렌즈 GFP 형광에 따라 같은 동물의 unoperated 측면에 호스트 렌즈에서 구분할 수 28.5 C.에서 알을 품다. 섹션은 또한 렌즈의 크기를 측정하고 제대로 차별화 여부를 확인 할 수 있습니다.

그림 1
그림. 렌즈 이식에 사용 날카롭게 바늘 1 낮은 배율 이미지. 모세관 유리 (B)은 파스퇴르 피펫 (A)에 삽입하고, 얇은 텅스텐 와이어 (C)은 모세관의 열린 끝을 삽입됩니다. 와이어를 통해 유리는 알콜 램프로 부드럽게합니다. 손으로 파스퇴르 피펫의 다른 쪽 끝을 비틀면서 집게를 사용하여 금속 와이어와 함께 꾸준한 유리 끝을시오. 부드럽게 유리 장소에 그것을 근사한, 금속 주위에 나선 것입니다.



그림. 렌즈 이식에 사용되는 바늘의 이가지 2 팁.


그림 3
그림. 3 태아는 30hpf에서 렌즈 이식을 받았습니다. 표시는 기증자의 배아 (A, B), 이식 렌즈 (C, D)으로 호스트 눈, 및 호스트 배아의 제어 측면 (E, F)입니다. 표시된 각 눈은 전송 빛과 자외선 조명 모두에 표시됩니다. 사진은 48 HPF에서 찍은. Q01 [9] 유전자 변형 라인이 실험에서 사용되었습니다.

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Discussion

여러 단계 렌즈 transplantations 중 특별한주의가 필요합니다.

  1. 바늘을 날카롭게 : 그것은 렌즈 이식을 수행하기 전에 몇 가지 바늘을 준비하는 것이 좋습니다, 그리고 바늘 끝이 가능한 얇은해야합니다. 두꺼운 바늘은 치료 눈에 실패를 초래하기 때문에 넓은 직경이 더 많은 조직을 찢어 것입니다.
  2. 배아를 정리 : 그들의 측면에 누워되도록 마우스 이식하기 전에 배아를 위치합니다. 위치하면, 1.2 % 아가로 오스는 강화는 매우 신속하게하실 수 있습니다. 아가로 오스의 경화 속도가 느린하려면, 페트리 접시는 그것이 40 ° C 물 욕조에서 부동 주어 preheated 수 있습니다.
  3. 호스트의 눈을 기증 렌즈를 삽입하기 전에 가능한 호스트 머리 주위에 많은 아가로 오스를 제거하려고합니다. 그것은 기증자 렌즈 그런식으로 삽입 쉽게.
  4. 그냥 렌즈 이식 후 배아가 0.2 % 아가로 오스 계층이 적용되는 1.2 % 아가로 오스 레이어에 포함된 남아 있어야합니다. 항생제와 배아 미디어를 추가하면 기증자 및 호스트 태아 모두에서 상처 치유를 촉진합니다. 아가로 오스의 배아를 공개하기 전에 30-60분 잠깐, 그리고 배아 매체와 함께 24 잘 판에 그들을 전송합니다.

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Acknowledgements

이 절차는 이식 기술은 빌 제프리의 실험실에 의해 동굴 물고기를 위해 개발된 광범위하게 따릅니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1mm diameter tungsten wire A Johnson Matthey 45086
Agarose(low melting point) Sigma-Aldrich 39346
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-4
Forceps Dumont 11252-30
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette pump Fisher Scientific 13-683C
Petri Dish Cardinal Health D1906
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
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  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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