在斑马鱼和镜头移植在眼突变分析中的应用

Published 6/01/2009
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Biology

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Summary

镜头的发展涉及到与其他组织的互动。几个的斑马鱼眼突变体的特点是异常的小镜头尺寸。在这里,我们展示了一个镜头移植实验,以确定这是否表型是由于内在的原因,或环绕镜头的组织,有缺陷的相互作用。

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Zhang, Y., McCulloch, K., Malicki, J. Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants. J. Vis. Exp. (28), e1258, doi:10.3791/1258 (2009).

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Abstract

镜头视杯[1,2]的发展起着重要的作用。使用斑马鱼作为模式生物,关于镜头发展的问题可以得到解决。斑马鱼是由于一些优势特点,包括体积小,繁殖力高,生命周期短,便于照顾的遗传研究非常有用。镜头发展迅速出现在斑马鱼。 72 HPF,斑马鱼的镜头功能成熟[3 ]。丰富的遗传和分子资源来支持在斑马鱼的研究。此外,斑马鱼眼的其他脊椎动物相似,提供其作为人类缺陷极好的动物模型 [4-7]使用的基础。一些斑马鱼突变体表现出镜头的异常,包括高水平的细胞死亡,在某些情况下会导致晶状体组织的一个完整的变性[8 ]。

为了确定是否镜头异常是由于内在的原因或与周围组织有缺陷的相互作用,一个突变成野生型眼晶状体移植。仔细解剖用火抛光的金属针,突变型或野生型镜头是从供体动物,并转移到主机。为了区分野生型和突变型的组织,转基因线是用来作为供体。该行表示在所有组织的膜结合型绿色荧光蛋白,包括镜头。这种移植技术在斑马鱼的镜头突变体的研究是必不可少的工具。

Protocol

第1部分:准备胚胎

在这个协议中,我们将使用JJ XY符号来表示一个假设的斑马鱼镜头突变。

  1. 斑马鱼品系均保持在28.5在14H light/10h暗周期彗星的标准鱼设施条件。
  2. 在晚上,斑马鱼应变JJ XY地方的男性和女性:AB / TU; TG(mGFP)在坦克与一个分频器,它们彼此分开。这种交叉的后代将表达绿色荧光蛋白基因,在所有组织和捐助者将被视为使用。同时,使用相同的步骤,设立非转基因的野生型动物之间的杂交。根据这个实验的目的,一是可以跨野生型动物在JJ XY捐助者或主机的轨迹。
  3. 在一个小时后光轮流在早晨,删除的分隔,让鱼交配。
  4. 15-30分钟后100 × 15 mm培养皿中的胚胎收集,清理,并更改的介质(鸡蛋水)。
  5. 直到所需的时间,保持在28.5彗星孵化器的胚胎。
  6. 移植准备时,除去绒毛膜手动两双锋利的镊子,并在0.2%EDTA孵化的胚胎,在30分钟的无钙ZFR。

第2部分:解剖针的制备

  1. 移植过程需要两种类型的针:削尖之一,它是用来切组织周围的镜头,删除绒毛膜,和琼脂糖释放胚胎;和钝针,用于将捐助者的镜头,并把它插入到主机。在这里,我们将向您展示如何使这些针。
  2. 首先,必须切断巴斯德吸管尖,使用钻石刀。然后插入到巴斯德枪头,所以,它的长度的一半左右里面是一个玻璃毛细管。这将使其更容易固定到玻璃熔化,在下一步的钨丝。
  3. 然后将其插入毛细管开口端薄的钨丝。熔体本生灯过线的玻璃。使用镊子,保持稳定的结束,而玻璃与金属丝扭针的另一端,用你的手。软化的玻璃周围的金属螺旋夹持到位。
  4. 如果你正在先端钝针,那么这个过程结束。要创建一个削尖的针头,缓缴本生灯钨丝为1-1.5分钟,燃烧掉的金属,因此非常精尖。检查microscropy.It针尖质量是一个好主意,立即移植前几秒钟都在火焰消毒的针头。

第3部分:试剂的制备

  1. 无钙斑马鱼林格(ZFR)解决方案(116毫米氯化钠,氯化钾2.9毫米,5毫米的HEPES,pH值7.2)
  2. 在无钙任氏斑马鱼的解决方案(pH值7.2)的0.2%EDTA
  3. 1.2%琼脂糖(熔点低)钙免费ZFR
  4. 0.2%琼脂糖(熔点低)钙免费ZFR
  5. 胚胎培养基(pH值7.0,每升含有:Hanks液#1 10毫升,1毫升Hanks液#2,10毫升Hanks液#4,10毫升Hanks液#5,碳酸氢钠0.35克,300 UL的2M盐酸,青霉素,链霉素50万ü) 在斑马鱼的书(俄勒冈州大学出版社,2000) 。
  6. 钨丝,镀金,直径0.1毫米,阿法埃莎
  7. 毛细管,1.0毫米直径,世界精密仪器

第4部分:移植过程

  1. 在一个塑料离心管中,准备在无钙ZFR 1.2%低熔点琼脂糖预热至40水浴彗星。
  2. 在所需的阶段(30 HPF,例如),巴斯德吸管胚胎,慢慢地驱逐他们的离心管,慢慢驱逐到离心管中,他们和孵化约5秒钟。捐助者和主机应该单独培养。
  3. 用移液器,在1.2%琼脂糖的胚胎从离心管中,并安排他们在一个100mm聚苯乙烯培养皿中的两排平行,保持独立的主机和捐助者。吹打缓慢而仔细地,大多数胚胎会趴在他们双方在琼脂糖。您将需要调整那些不在于在这个位置上,使眼睛朝上琼脂糖凝固前使用钝针。
  4. 等待的1.2%琼脂糖巩固,然后用0.2%低熔点琼脂糖溶液覆盖。
  5. 使用削尖的针,消除眼睛周围的任何琼脂糖,非常仔细地减少从主机和使用小中风的捐助胚胎镜头。确保削减足够接近镜头,以免撕裂它,但也因此您不必删除从主机眼睛休息太多的组织。
  6. 一旦获得了自由,镜头将浮在介质。使用钝针,小心地推捐助镜头正上方的位置所在的主机的镜头通常会,然后推入眼睛,用钝针头。主机镜头可能会被丢弃。
  7. 捐助者和东道国胚胎留在1.2%琼脂糖30-60分钟,然后释放他们从琼脂糖用锋利的针,并转移到与胚胎培养基的24孔板。每个胚胎中应占有一个独立的井。请一定要正确,所以,这是明确的主机对应的捐助标签井。
  8. 基于GFP荧光同一动物unoperated捐助派生的镜头,可以从主机镜头杰出上,在28.5℃孵育。节也可以提出来衡量镜头的大小,以确定它是否正确区分。

图1
图1低倍率镜头移植使用的削尖针形象。一个玻璃毛细管(二)被插入到巴斯德吸管(一),薄的钨丝(C)是毛细管开口端插入。过线的玻璃软化本生灯。使用镊子,保持稳定的结束,而玻璃与金属丝扭巴斯德吸管的另一端,用你的手。软化的玻璃周围的金属螺旋,夹持到位。



图2镜头移植使用的两种针的小技巧。


图3
图3胚胎进行移植镜头在30hpf。显示的是一个捐助者的胚胎(A,B),主机上移植镜头(C,D)眼,主机胚胎的控制端(E,F)。每只眼睛是在透射光及紫外光照射。照片是在48 HPF。在本实验中使用的Q01 [9]转基因株系。

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Discussion

有几个步骤需要特别注意在镜头移植。

  1. 锐利的针:这是更好地开展晶状体移植前的准备几针,针的尖端应尽可能薄。一个较厚的针将撕裂更因为它的直径更广泛的组织,造成眼睛未能愈合。
  2. 安排的胚胎,移植前,您必须胚胎的位置,所以他们就躺在他们身边。当定位,1.2%琼脂糖硬化速度非常快。要缓慢琼脂糖硬化,培​​养皿可以让它漂浮在40℃水浴预热。
  3. 插入主机眼捐助镜头前,尝试删除主机头周围尽可能多的琼脂糖。它更容易插入捐助的镜头。
  4. 正如镜头移植后的胚胎应留给嵌入在1.2%琼脂糖由0.2%琼脂糖凝胶层覆盖层。胚胎培养基用抗生素添加,将促进捐助者和东道国胚胎伤口愈合。等待30-60分钟,从琼脂糖之前释放胚胎,然后转移到24孔板中,他们与胚胎培养基。

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Acknowledgements

此过程如下很大程度上条例草案“杰弗里实验室移植技术开发洞穴鱼。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1mm diameter tungsten wire A Johnson Matthey 45086
Agarose(low melting point) Sigma-Aldrich 39346
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-4
Forceps Dumont 11252-30
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette pump Fisher Scientific 13-683C
Petri Dish Cardinal Health D1906
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122

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References

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
  3. Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
  4. Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344, (4), 532-542 (1994).
  5. Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23, (11), 531-541 (2000).
  6. Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42, (4), 527-533 (2002).
  7. Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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