Lens trapianto in Zebrafish e la sua applicazione nell'analisi dei Mutanti Eye

Biology

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Summary

Lente sviluppo comporta interazioni con altri tessuti. Diversi mutanti occhio zebrafish sono caratterizzati da una dimensione lente anormalmente piccole. Qui mostriamo un esperimento di trapianto di lente per determinare se questo fenotipo è dovuto a cause intrinseche o le interazioni difettoso con tessuti che circondano l'obiettivo.

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Zhang, Y., McCulloch, K., Malicki, J. Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants. J. Vis. Exp. (28), e1258, doi:10.3791/1258 (2009).

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Abstract

La lente ha un ruolo importante nello sviluppo della coppa ottica [1,2]. Utilizzando il pesce zebra come organismo modello, le domande riguardanti lo sviluppo dell'obiettivo può essere affrontato. Il pesce zebra è utile per studi di genetica a causa di diverse caratteristiche vantaggiose, tra cui piccole dimensioni, ad alta fecondità, del ciclo di vita breve, e la facilità di cura. Sviluppo lente avviene rapidamente in zebrafish. Da 72 HPF, l'obiettivo zebrafish è funzionalmente maturo [3]. Abbondanti risorse genetiche e molecolari sono a disposizione per sostenere la ricerca in zebrafish. Inoltre, la somiglianza degli occhi zebrafish a quelle di altri vertebrati fornisce basi per il suo uso come un modello animale eccellente di difetti umani [4-7]. Zebrafish mutanti diversi mostrano anomalie lente, tra cui alti livelli di morte cellulare, che in alcuni casi conduce ad una completa degenerazione dei tessuti lente [8].

Per determinare se le anomalie lente sono dovuti a cause intrinseche o difettoso interazioni con i tessuti circostanti, il trapianto di un obiettivo mutante in una wild-type occhio viene eseguita. Utilizzando fuoco lucido aghi di metallo, lenti mutante o wild-type sono accuratamente sezionati dall'animale donatore, e trasferiti nell'ospite. Per distinguere i tessuti wild-type e mutanti, una linea transgenica viene utilizzato come donatore. Questa linea esprime legata alla membrana GFP in tutti i tessuti, compresa la lente. Questa tecnica di trapianto è uno strumento essenziale negli studi di mutanti lente zebrafish.

Protocol

Parte 1: Preparazione degli embrioni

In questo protocollo, useremo il simbolo jj xy per indicare un ipotetico mutante lente zebrafish.

  1. Zebrafish ceppi sono mantenuti in condizioni standard impianto di pesce a 28,5 C su un ciclo di 14h light/10h buio.
  2. In serata, maschi e femmine posto del ceppo zebrafish jj xy: AB / TU; tg (mGFP) in una vasca con un divisore per separare l'uno dall'altro. La progenie di questa croce che esprimono il transgene GFP in tutti i tessuti, e saranno utilizzati come donatori. In parallelo, utilizzare la stessa procedura per creare incroci tra non transgenici wild-type animali. A seconda dello scopo di questo esperimento, si può attraversare animali wild-type a livello del locus jj xy come donatori o host.
  3. Entro un'ora dopo la luce si accende al mattino, togliere i divisori per consentire al pesce di accoppiarsi.
  4. Dopo 15-30 minuti raccogliere embrioni in 100 piatti mm x 15 Petri, pulirli, e cambiare il mezzo (acqua uovo).
  5. Mantenere gli embrioni in C 28,5 incubatore fino al momento desiderato.
  6. Quando si è pronti per il trapianto, rimuovere il corion manualmente con due paia di pinze taglienti, e incubare gli embrioni nel 0,2% EDTA di calcio senza ZFR per 30 minuti.

Parte 2: Preparazione di aghi di dissezione

  1. Le procedure di trapianto richiede due tipi di aghi: uno affilato, che viene utilizzato per tagliare tessuti circostanti la lente, rimuovere il corion, e gli embrioni rilascio di agarosio, e un ago smussato utilizzato per spostare la lente dei donatori e inserirlo nella ospitante. Qui vi mostreremo come fare questi aghi.
  2. In primo luogo, la punta di una pipetta Pasteur deve essere tagliato con un coltello di diamante. Quindi inserire un capillare di vetro nella punta della pipetta Pasteur in modo che circa la metà della sua lunghezza è al suo interno. Questo renderà più facile per immobilizzare il filo di tungsteno da fusione nel bicchiere nella fase successiva.
  3. Quindi inserire un sottile filo di tungsteno nella parte aperta del capillare. Fate fondere il vetro sopra il filo con un becco Bunsen. Uso di pinze, tenere ferma la fine di vetro con il filo metallico mentre torcendo l'altra estremità dell'ago con la mano. Il vetro dovrebbe ammorbidito a spirale attorno al metallo è presa in posizione.
  4. Se si stanno facendo un ago punta smussata, allora questa è la fine della procedura. Per creare un ago appuntito, tenere il filo di tungsteno nel corso di un becco Bunsen per 1-1,5 minuti, bruciando il metallo così una punta molto fine è stato creato. Controllare la qualità della punta da microscropy.It è una buona idea per sterilizzare gli aghi sia nella fiamma per alcuni secondi immediatamente prima del trapianto.

Parte 3: Preparazione dei reagenti

  1. Calcio senza Zebrafish Ringer (ZFR) Soluzioni (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 5 HEPES mM, pH 7,2)
  2. 0,2% EDTA di calcio senza soluzioni Zebrafish Ringer (pH 7,2)
  3. 1,2% di agarosio (basso punto di fusione) di calcio senza ZFR
  4. 0,2% di agarosio (basso punto di fusione) di calcio senza ZFR
  5. Medio embrione (pH 7,0, per ogni litro contiene 10 ml di soluzione Hanks # 1, 1 ml Soluzione Hanks # 2, 10 ml Soluzione Hanks # 4, 10 ml Soluzione Hanks # 5, 0,35 g di sodio bicarbonato, 300 uL di HCl 2M, penicillina-streptomicina 500.000 U) come nel libro Zebrafish (University of Oregon Press, 2000).
  6. Filo di tungsteno, oro placcato, diametro 0.1mm, Alfa Aesar
  7. Capillare, diametro 1,0 millimetri, Mondo Strumenti di precisione

Parte 4: Procedura di trapianto

  1. In una provetta di plastica, preparare 1,2% agarosio a basso punto di fusione di calcio senza ZFR preriscaldato a 40 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Nella fase desiderato (30 HPF, per esempio), prendere gli embrioni in una pipetta Pasteur, lentamente li espellono in provetta, e lentamente li espellono in provetta da centrifuga e incubare per circa 5 secondi. I donatori e gli host devono essere incubate separatamente.
  3. Con una pipetta, prendere gli embrioni a 1,2% agarosio dalla provetta e disporli su due file parallele in un piatto da 100 millimetri polistirolo Petri, mantenendo gli host e donatori separati. Pipettando fuori lentamente e con attenzione, la maggior parte degli embrioni si trovano su un fianco in agarosio. Avrete bisogno di riorientare quelli che non si trovano in questa posizione utilizzando l'ago smussato in modo che l'occhio è rivolto verso l'alto prima che l'agarosio si solidifica.
  4. Attendere il 1,2% di agarosio a solidificare, e poi sovrapporre con lo 0,2% soluzione a basso punto di fusione di agarosio.
  5. Utilizzando l'ago affilato, rimuovere eventuali agarosio intorno agli occhi, e con molta attenzione tagliare la lente fuori dal host e embrioni donatore con piccoli colpi. Assicurati di tagliare solo abbastanza vicino all'obiettivo per non strapparla, ma anche in modo da non rimuovere il tessuto troppo dal resto dell'occhio ospitante.
  6. Una volta libero, lenti galleggia nel mezzo. Utilizzando l'ago senza punta, con attenzione spingere il donatorelente a poco sopra la posizione in cui l'obiettivo ospitante sarebbe normalmente, e poi spingere verso il basso in un occhio con l'ago smussato. L'obiettivo ospitante può essere scartata.
  7. Lascia embrioni donatore e ospite in agarosio 1,2% per 30-60 minuti, poi la liberazione dal agarosio utilizzando l'ago appuntito, e trasferirli in un 24-pozzetti con media embrione. Ogni embrione deve occupare una ben separati. Assicurarsi di etichettare i pozzi correttamente in modo che sia chiaro quale host corrisponde a quale donatore.
  8. Incubare a 28,5 C. Il donatore-derivati ​​obiettivo può essere distinto dalla lente ospitare sul lato non operato dello stesso animale in base a fluorescenza GFP. Le sezioni possono essere fatte anche per misurare le dimensioni dell'obiettivo e per determinare se si differenzia in modo corretto.

figura 1
Fig. 1 immagine a basso ingrandimento di un ago affilato utilizzato per il trapianto di lente. Una capillare di vetro (B) viene inserito nella pipetta Pasteur (A), e un sottile filo di tungsteno (C) viene inserito l'estremità aperta del capillare. Il vetro sopra il filo è ammorbidito con un becco Bunsen. Uso di pinze, tenere ferma la fine di vetro con il filo metallico mentre torcendo l'altra estremità della pipetta Pasteur con la mano. Il vetro dovrebbe ammorbidito a spirale attorno al metallo, presa in posizione.



Fig. 2 Le punte dei due tipi di aghi usati per le lenti trapianto.


figura 3
Fig. 3 embrioni sottoposti a trapianto di lenti a 30hpf. Vengono mostrati un embrione donatore (A, B), un occhio host con obiettivo trapiantato (C, D), e il lato di controllo dell'embrione ospitante (E, F). Ogni occhio è mostrato in entrambe luce trasmessa e illuminazione UV, come indicato. Fotografie sono state scattate a 48 HPF. Il Q01 [9] linea transgenica è stato utilizzato in questo esperimento.

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Discussion

Diversi passaggi richiede un'attenzione particolare durante trapianti lente.

  1. Aghi affilati: E 'meglio preparare gli aghi diversi prima di effettuare il trapianto di lenti, e la punta degli aghi deve essere il più sottile possibile. Un ago più spesso si lacerano il tessuto più a causa del suo diametro più ampio, causando un guasto negli occhi per guarire.
  2. Organizzare gli embrioni: Giusto prima del trapianto è necessario posizionare gli embrioni in modo che siano coricati su un fianco. Durante il posizionamento, il 1,2% di agarosio può indurirsi molto rapidamente. Per rallentare l'indurimento di agarosio, la piastra di Petri possono essere preriscaldato lasciandolo fluttuare in un bagno d'acqua 40 ° C.
  3. Prima di inserire la lente donatore nell'occhio ospite, tenta di rimuovere il più agarosio intorno alla testa host come possibile. E 'più facile inserire l'obiettivo donatore in questo modo.
  4. Subito dopo il trapianto lente degli embrioni devono essere lasciati incorporato nello strato di agarosio 1,2% coperto da uno strato di agarosio 0,2%. L'aggiunta di medio embrione con antibiotici promuoverà la guarigione delle ferite sia del donatore ed embrioni di accoglienza. Attendere 30-60 minuti prima di rilasciare embrioni di agarosio, e poi trasferirli in un 24-pozzetti con media embrione.

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Acknowledgements

Questa procedura segue in larga misura la tecnica di trapianto predisposti per i pesci grotta dal laboratorio di Bill Jeffrey.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1mm diameter tungsten wire A Johnson Matthey 45086
Agarose(low melting point) Sigma-Aldrich 39346
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-4
Forceps Dumont 11252-30
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette pump Fisher Scientific 13-683C
Petri Dish Cardinal Health D1906
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122

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References

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
  3. Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
  4. Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344, (4), 532-542 (1994).
  5. Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23, (11), 531-541 (2000).
  6. Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42, (4), 527-533 (2002).
  7. Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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