到大脑的门户:剖析灵长类动物的眼睛

Biology

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Summary

非人类灵长类动物是我们的发育和衰老的理解的重要翻译物种。灵长类动物视网膜的解剖组织可能为在人体正常和病理条件下的重要见解。

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Burke, M., Zangenehpour, S., Bouskila, J., Boire, D., Ptito, M. The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye. J. Vis. Exp. (27), e1261, doi:10.3791/1261 (2009).

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Abstract

在人类的视觉系统被认为是世界的门户和过多的感官,知觉和认知过程中起着主要作用。因此,并不令人惊讶的视觉质量与生活质量。尽管广泛的临床和基础研究周围的视觉障碍的原因,许多形式如色素性视网膜炎和黄斑变性,视力障碍,缺乏有效的治疗方法。非人类灵长类动物的最接近人类的眼球发育一般特征。他们不仅有类似的血管解剖,但其他哺乳动物,包括灵长类动物有独特的特征,在一个区域专门用于高视力,黄斑中心凹视网膜颞

Protocol

第1部分:前处理的组织

  1. 组织应多聚甲醛,戊二醛,或福尔马林灌注。这可以通过标准transcardial,通常用于收获其他器官灌注。建议后不久牺牲的眼睛被注入固定液,只是镜头下的固定液中。
  2. 在本研究的主题是深刻的盐酸氯胺酮(10毫克/公斤,IM)与戊巴比妥钠(25毫克/公斤,四)过量安乐死,镇静剂和用0.1 M PBS灌注,直到完全exsanguinated transcardially人。其次是在PBS的4%多聚甲醛为5分钟(约1升)的解决方案。

第2部分:眼球去除眶腔

  1. 更容易获得眼球,建议先取出大脑。一旦大脑已被删除的薄壁轨道骨是显而易见的。使用骨rongeurs慢慢芯片了墙上的轨道。用手术刀切去眼部肌肉和结缔组织从眼球中删除。小心地剪断视神经,这可以用在电子显微镜研究。眼球,现在应该被释放的眶腔。

第3部分:视网膜解剖从眼罩

  1. 放入一个培养皿中,用PBS保持干燥视网膜的眼睛。在解剖显微镜或表安装在解剖放大光的立场是有益的,但​​不是必须的。取出一双弹簧剪刀锯齿缘水平密切切割巩膜角膜周边角膜和钳取出镜头。
  2. 使用画笔,镊子,和弹簧剪刀去除巩膜视网膜。这是脱离巩膜视网膜,然后用剪刀切割巩膜,。我们必须开展以小增量这个过程中,以免损伤或撕裂的视网膜组织。巩膜是不容易分开的残余视神经这么仔细地减少视神经周围巩膜。
  3. 此时视网膜保留其弯曲的形状,需要进行采样夷为平地。在扁平化的视网膜,玻璃体,里面有果冻的一致性,可以去掉一笔。要拉平到幻灯片上的视网膜,用手术刀刀片的径向削减。残留的玻璃体,现在可以删除与普通过滤纸和画笔。在这一点上,所以它必须要轻柔取出时玻璃体视网膜神经节细胞层暴露。如果视神经仍然附着在视盘,删除不使用手术刀刀片和一对弹簧剪刀翻录的视网膜视神经。这是一个平坦的装载视网膜中央凹(图1)和应作为一个黑暗的补丁在视盘颞/腹侧方向明显。

第4部分:采样

  1. 有很多的选项,抽样视网膜。在这里,我们将描述flatmount准备和isodentric采样。对于这两个程序flatmount视网膜与视神经纤维层离幻灯片。如果意图是在flatmount准备检查视网膜神经节细胞层,这是必要的删除或漂白色素上皮。为了消除色素上皮使用画笔轻轻去除这层,这往往会损坏感光层。漂白涉及视网膜浸泡在高锰酸钾溶液(0.25%),1小时,用蒸馏水洗涤,并结算草酸(5%)5 分钟 2 。
  2. 如果目的是研究整个视网膜细胞的分布和每一层的形态,那么我们建议视网膜等距抽样。视网膜应flatmounted幻灯片上,用PBS,并保持湿润。对于等距抽样切小块组织从视盘鼻,颞部,上下方向(图1)等距。这是没有必要的准备漂白色素上皮的。这些作品现在可以在冠状面切片与一个恒温器,vibratome,或根据所研究的问题ultramicrotome。低温恒温切片,件应在30%蔗糖过夜和cryoprotected,在安装介质上干冰中冷冻。另外,样品可以嵌入琼脂,在一个vibratome切片。低温恒温器和vibratome准备工作,将可靠的产量高达4米薄的部分如果需要较薄(例如电子显微镜准备),这是必要的,准备ultramicrotome样品。要做到这一点,部分应在四氧化锇后固定的通风柜下为1小时。其次是在梯度乙醇系列脱水(50,70,95,95,100,100%)和100%的环氧丙烷。组织然后嵌入在EPON(EMBED - 812嵌入套件)。

第5部分:代表性的成果:

在我们的实验室,我们进行常规免疫组织化学cryosectioned视网膜(图2)。在这种情况下,我们感兴趣的是在灵长类动物视网膜的大麻素受体(CB1)等密度。我们还研究灵长类动物的视觉系统的产前乙醇暴露的影响。为此,我们有兴趣在黄斑中心凹,并在周边视网膜细胞密度和层厚度。而要做到这一点,我们在EPON中嵌入视网膜件,切片在700nm的上ultramicrotome,和染色用1%甲苯胺蓝(图3)。

图1
图1 Flatmount视网膜。径向削减用于扁平化的视网膜。

图2
图2免疫染色。周边视网膜Cryosection免疫染色为CB1视网膜神经节细胞很大程度上与一些内部和外部的核层的标签标示。本节的厚度为14米,在幻灯片上染色。 RG - 视网膜神经节层,IP - 内丛状层; - 内核层; OP - 外丛状层; - 外核层。

图3
图3通过嵌入在EPON和切片在700nm的ultramicrotrome中心凹中心凹。节。感光层(PR)是用于调整的部分。请注意,显示在冠状面的一个适当的角度可以识别的整个范围的光感受器。密度测量在300米,500米和800米Bioquant成像系统的中心凹坑中心。

RG - 视网膜神经节层,IP - 内丛状层; - 内核层; OP - 外丛状层; - 外核层;比例尺= 50米

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Discussion

准备允许作为wholemount视网膜的神经节细胞层,或视网膜血管 3内皮细胞的地形和空间分布的分析。在灵长类动物的视网膜边缘的细胞密度的量化很容易完成。然而,在perifoveal和中心凹区域,堆积在神经节细胞层的多层次的阻碍量化。为了规避这种潜在的偏见,黄斑中心凹和perifoveal地区可以解剖从wholemount准备,嵌在EPON,并连续切片使用ultramicrotome获得半薄切片,在冠状 2,4 。有wholemount准备,可替代采样范式克服了其他一些缺点。

从视网膜到等距样本和一个低温恒温器或vibratome在冠状面切片,允许为不同的层次,它不能轻易上wholemount准备进行具体检查。在这种方式切片也允许应用多个immnohistochemistry协议5。这些部分可以从幻灯片中删除,嵌入在EPON上ultramicrotome的切片。随着标准的冠状面,以确保通过感光器,可在切割的角度ultramicrotome轻微变化。一旦一个标准的飞机已获得层厚度可以测量和视网膜地区和学科之间的比较。此外,EPON包埋组织,可用于在电子显微镜研究,揭示视网膜超微结构特征 6 。

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Acknowledgments

作者想感谢他的技术支持Ikiel Ptito。弗兰克欧文,罗伯塔Palmour和行为科学基金会设在圣基茨实验室,西印度群岛,为他们继续支持我们的灵长类动物的工作人员,我们非常感谢。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blades Fine Science Tools 10011-00
Spring scissors Fine Science Tools 15020-15
Scissors Fine Science Tools 14090-11 Any surgical scissors are sufficient
Rongeurs Fine Science Tools 16121-14
Forceps Fine Science Tools 11027-12
Filter paper Fisher Scientific 09-924-150
Camel or Sable Hair paintbrush Any Supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
  2. Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
  3. Stone, J. The Wholemount Handbook. Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
  4. Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
  5. Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. Springer-Verlag. New York. (1991).
  6. Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).

Comments

1 Comment

  1. nice video. however, the part where you removed the vitreous with a white paper was way too fast. I tried to look in your text on info of how you removed the vitreous but couldn't find it. it would be great if you could clarify this crucial aspect of the procedure.

    Reply
    Posted by: u.
    October 20, 2015 - 4:43 AM

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