Creazione di Murine aneurismi dell'aorta addominale Sperimentale con elastasi

Published 7/23/2009
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Biology

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Summary

Questo video mostra come per indurre aneurismi dell'aorta addominale (AAA) nei topi via transitoria infusione intraluminale di elastasi pancreatica porcina nel segmento infrarenale dell'aorta addominale. Il modello ha la possibilità di aggiungere visione ampia in biologia e la patologia di AAA per la nascita di numerose transgenici e topi knockout del gene.

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Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase . J. Vis. Exp. (29), e1280, doi:10.3791/1280 (2009).

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Abstract

Transitori infusione intraluminale di elastasi pancreatica porcina nel segmento infrarenale dell'aorta addominale è il modello animale più usato di aneurisma dell'aorta addominale (AAA) da quando è stata descritta per la prima nei ratti da Anidjar e colleghi. 1 Il razionale per il suo sviluppo si è basata sulla natura interrotto di elastina osservato in AAA. Questo modello di ratto è stato modificato per produrre AAA nella regione aortica infrarenale di topi. 2 Il modello ha la possibilità di aggiungere visione ampia in biologia e la patologia di AAA per la nascita di numerose transgenici e topi knockout del gene. Inoltre, è una valida piattaforma per testare potenziali agenti terapeutici per AAA. In questo video, dimostriamo la procedura di elastasi infusione AAA utilizzato nel nostro laboratorio.

I topi vengono anestetizzati con isoflurano 2,5%, e una laparotomia viene eseguita in condizioni sterili. Il aortais addominale isolato con l'aiuto di un stereomicroscopio operativo (Leica). Dopo aver posizionato le legature temporaneo intorno dell'aorta prossimale e distale, un aortotomy viene creato alla biforcazione con la punta di un 30-gauge. Un calore-conica segmento di tubo in polietilene PE-10 è introdotto attraverso il aortotomy e assicurato. Il lume aortico è successivamente perfuso per 5-15 minuti a 100 mm Hg con soluzione salina di tipo I contenenti elastasi pancreatica porcina (4,5 U / mL; Sigma Chemical Co.). Dopo aver rimosso il catetere perfusione, la aortotomy viene riparato senza restringimento del lume.

Protocol

  1. I topi vengono anestetizzati con isoflurano inalato 2.0 3.0ml / L.
  2. L'addome è rasata e rimosso con alcool e Betadine.
  3. Il mouse è posizionato supino sul campo operatorio.
  4. Guanti sterili sono indossati dal chirurgo, e gli strumenti utilizzati sono stati sterilizzati con acqua calda sterilizzatore tallone.
  5. Una lunga incisione addominale mediana è fatto. Contenuto addominale sono ritratta fuori l'addome con una garza sterile per esporre l'aorta addominale.
  6. L'aorta addominale è isolato dal livello della vena renale sinistra alla biforcazione.
  7. I rami dell'aorta addominale sono esposti e legatura 10-0 con punti di sutura. Tutti i rami aortica 1,0 centimetri all'interno della biforcazione sono legato.
  8. Temporaneo 6,0 legature di seta sono disposte intorno al porzioni prossimale e distale dell'aorta
  9. Un aortotomy è creata alla biforcazione con un 30-gauge.
  10. Calore-tubi conici in polietilene (PE-10) è introdotto attraverso il aortotomy e fissato con un pareggio.
  11. Utilizzando una borsa salina appeso all'altezza di 136 cm a calibrare 100 mmHg, l'aorta è riempito con la soluzione fisiologica contenente 4,5 U / mL di tipo I suini elastasi pancreatica. L'aorta si dilata normalmente a 150-170% del suo diametro originale durante la perfusione elastasi 5-15 minuti.
  12. Il catetere perfusione viene quindi rimosso e il aortotomy chiuso con una sutura 10-0 per evitare la costrizione.
  13. Dopo la aortotomy è chiuso, la legatura distale viene rimosso.
  14. Se vi è poca o nessuna emorragia dal aortotomy riparato, la legatura prossimale viene rimosso. L'aorta ampliato riempie di sangue immediatamente.
  15. Gli intestini sono restituiti al ventre, e la ferita è chiusa in due strati con 6-0 in nylon / polipropilene sutura.
  16. 0,25% Bupivicaime gocce (una goccia appx per ogni centimetro di dimensioni incisione) sono posti sulla ferita e una dose di Caprofen (5mg/kg) è somministrato per via sottocutanea.
  17. Il mouse è posizionato su una zona calda e recupera in genere entro 15 minuti.

Figura 1
Figura 1. Risultato rappresentante di elastasi indotta AAA.

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Discussion

Precedenti studi hanno notato notevoli lotto a lotto variazione sviluppo AAA da differenti preparazioni elastasi commerciale 3. Quindi, è fondamentale per il monitoraggio dei lotti di produzione così come di avere gruppi di controllo appropriate al fine di documentare la capacità della preparazione per indurre AAA.

È interessante notare che la suscettibilità allo sviluppo di AAA in questo modello dipende dal ceppo di topi utilizzato 3. Il mouse usato nel video corrente è del ceppo C57BL / 6 che è lo sviluppo coerente di AAA utilizzando il protocollo descritto. Concentrazione elastasi e / o tempo di incubazione può essere regolata per ospitare altri ceppi.

Sebbene la tecnica di creazione di AAA con elastasi nei topi è tecnicamente impegnativo, è una tecnica importante per studiare i meccanismi molecolari alla base della formazione di AAA e di sviluppo. Modifiche pratiche e tecniche hanno portato ad un tasso di successo superiore al 90% nel nostro laboratorio. Crediamo che il video e il testo di accompagnamento contribuirà a ridurre la curva di apprendimento per i laboratori che desiderano utilizzare questa tecnica.

Risoluzione dei problemi

  1. I rami dell'aorta addominale deve essere legata 10-0 con punti di sutura, arrestando il sanguinamento durante l'operazione e di espansione insufficiente durante l'infusione elastasi a causa di perdite.
  2. E 'importante avere un campo operatorio chiara ed espansivo. Pertanto, l'uso 6-0 sutura invece di morsetti per occludere temporaneamente l'aorta
  3. Il lume dell'aorta addominale deve essere cancellato con una soluzione salina per prevenire la trombosi dopo l'operazione.
  4. E 'importante che la punta del calore conica PE-10 tubo deve essere liscia per evitare di graffiare lo strato endoteliale quando viene inserito.
  5. Le bolle d'aria all'interno dei vasi dovrebbero essere evitati quando infondendo elastasi così come quando il aortotomy è chiuso.

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Acknowledgements

Questo lavoro è stato la concessione SCCOR "Malattia AAA: Meccanismi, Stratificazione e trattamento" (P50 HL083800-03) dal National Institutes of Health

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Type I porcine pancreatic elastase Reagent Sigma-Aldrich E1250
polyethylene tubing (PE-10) BD Biosciences 427400
CHANGE-A-TIP Bovie Medical Corporation 18010-00 (FST) cautery knife
LEICA MZ6 Leica Microsystems stereomicroscope
LEICA DFC290HD Leica Microsystems USB camera
Image Pro Express ver. 6.0 Media Cybernetics Inc. software

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References

  1. Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82, (3), 973-973 (1990).
  2. Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105, (11), 1641-1641 (2000).
  3. Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 33, (6), 1255-1255 (2001).

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