在整个猴脑进行大规模蛋白质检测的批次免疫染色

Biology

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Summary

大型整个灵长类动物大脑的靶蛋白的免疫检测是采用新颖的组织包埋,切片与创意仪器在某一特定时间使用多个自由浮动的部分批次的染色相结合的方法。

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Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain. J. Vis. Exp. (29), e1286, doi:10.3791/1286 (2009).

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Abstract

免疫组织化学(IHC)是使用最广泛的实验室技术的一个靶蛋白的检测

Protocol

免疫组织化学是最广泛使用的技术在各种实验动物模型的大脑蛋白的表达特征之一。这是比较容易进行系统的免疫程序,对大脑的大小相似的老鼠与其他常见的实验模型的大脑。然而,有没有发表的作品,以我们的知识,提供了一个综合考虑如何开展在整个猴脑等免疫检测程序。以下是详细描述了如何准备进行大规模的各种目标蛋白的免疫组织化学检测整个猴脑。这项工作已经成为商业和学术的努力之间的协作。因此,有关组织包埋和切片的细节仍然是国家安全局的专有知识。

第1部分:动物治疗和组织准备

vervet从成年猴子的大脑(这两起)用于本议定书。所有的程序都遵守了对加拿大动物保护理事会(廉署)在生物医学研究 1的动物护理和使用的指导方针。

  1. 盐酸氯胺酮(10毫克/公斤,IM)与过量戊巴比妥钠(25毫克/公斤,IV)和灌注用0​​.1 M PBS transcardially直至完全exsanguinated安乐死,动物是深受镇静剂。
  2. 其次是在PBS的4%多聚甲醛为5分钟(约1升)的解决方案。
  3. 外向的大脑是摆在分级PBS缓冲的蔗糖溶液中含有0.02%叠氮化钠(10,20和30%的序列,),并保持在4˚C直到的大脑沉入容器底部。解决的办法是更换每隔几天,直到大脑进行冷冻切片。
  4. 大脑发送神经科学协会(NSA;诺克斯维尔,田纳西州)受到他们的专有MultiBrain™嵌入和冷冻切片技术。
  5. 被放置在嵌入矩阵,使部分可以导向正确(即左,右方向),并重新调整组织学处理完成后七(7)对齐地标。
  6. 冻块数字拍到在块面,在每个串行部分是从块收集。后的数字图像,以及从这个大脑的部分可以用于三维重建的解剖和组织学的地图。
  7. 串行自由浮动的冠状切片,在每节50微米的厚度,收集从整个大脑。

第2部分:组织学处理

部分选择在给定的空间间隔(例如,500微米)和我们的实验目的是与下面的抗体处理:脆性X智力迟钝蛋白(FMRP的; Chemicon公司;特曼库拉,CA),SMI32(Sternberger单克隆抗体公司;马里兰州巴尔的摩市)和NeuN(Chemicon公司;特曼库拉,CA)。 FMRP是一种胞浆蛋白,大量存在于正常和置换载体大脑的神经元2。 NeuN(神经元细胞核)明确承认,这是目前在大多数神经元和分布在神经元细胞核,perikarya和一些 3个神经元突起的神经元特异性DNA结合蛋白NeuN。 SMI - 32是一种单克隆抗体,承认非磷酸化神经丝蛋白4的抗原表位。

  1. 在一个500微米的间隔,大约140节,每抗体。
  2. 所有的孵育,洗涤和染色步骤进行轻度使用专门的染色菜和篮子(HistoTools;诺克斯维尔,田纳西州)的鼓动。
  3. 第孵育在含有0.1 mol PBS/0.3%TRITON X - 100(TX)/ 5%的正常沙哑的血清(NHS)的为60分钟,以减少非特异性结合的抗体分子,以及由此产生的背景染色的解决方案。
  4. FMRP的免疫标记的部分进行一个额外的步骤,根据供应商的说明使用的抗原的揭露解决方案(矢量实验室;伯林格姆,CA)的抗原回收。
  5. 节是再孵育过夜,并在其各自的抗体含有0.1中号PBS/0.3%的TX / 3%的国民保健服务(一个1 / 5,FMRP和SMI - 32和1 / 2,000 000 NeuN抗体稀释因素的解决方案单独天。
  6. 第二天,在洗涤液中10分钟三个时期孵育生物素标记的抗鼠二在马提出的抗体在室温下2小时(矢量实验室(0.1 M的PBS/0.3%TX),1 /路段被冲1000稀释PBS/0.3中号0.1%的TX / 3%的国民保健服务)。
  7. 进一步树立了3个10分钟的清洗后,部分被放置在生物素 - 亲和素标记的辣根过氧化物酶复合物在室温下1小时(矢量实验室)的解决方案。
  8. 最后,另一套清洗后,​​部分是受到一个镍增强直径为10分钟minobenzidine(镍DAB)反应产生深蓝色染色阳性神经元内。
  9. 完成的病理过程中,部分是安装在明胶包被的玻片。
  10. 所有部分都空气干燥过夜,并coverslipped根据标准程序。

第3部分:代表性的成果:

这种方法产生一个完整的表达谱,靶蛋白的兴趣在整个猴脑。在这里,我们展示代表,提供了FMRP的快照,NeuN和SMI32在表达相同的猴脑冠状切片。

图1:染色盘(A)和篮子(二)用于免疫检测的自由浮动的部分进行大规模的批量处理的。

图2:代表FMRP的(一),NeuN(B)和SMI32(三)抗体染色从vervet猴子大脑冠状切片。

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Discussion

在此过程中有两个关键的步骤,使大规模蛋白质的检测可能在整个猴脑。一个是嵌入和切片的协议,这仍然是国家安全局的专有知识。另一种是使用染色HistoTools提供的菜肴和篮子。后者可以方便,迅速地处理许多在某一特定时间(〜40)部分。它还提供了整个大脑的所有部分统一处理手段,使一个科学合理的组织学治疗。此外,嵌入式的标志性建筑的使用提供了额外的优势,能够以数字方式获取干燥和coverslipped幻灯片染色模式和各种形式的分析主体的数字化文件。虽然我们提供三种抗体的例子,这个过程可以应用于广泛的其他目标蛋白以及组织学污渍,特别是那些揭示各种皮质区的细胞结构,因此使用映射的目的。

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Acknowledgments

弗兰克欧文,罗伯塔Palmour和行为科学基金会在位于西印度群岛,圣基茨,为他们继续支持我们的灵长类动物的工作的实验室工作人员,我们非常感谢。这项工作是由来自加拿大脆性X研究基金会(FXRFC)深圳和的奖学金 - 由加拿大卫生研究院(AC)和加拿大(MP)的国家工程研究理事会研究院的运营赠款支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-FMRP monoclonal antibody Chemicon International MAB2160 Requires antigen retrieval in fixed tissue.
anti-NeuN monoclonal antibody Chemicon International MAB377 N/A
anti-Neurofilament H monoclonal antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI32 N/A
Antigen Unmasking Solution Vector Laboratories H-3300 N/A
Normal horse serum Invitrogen 16050122 500 mL
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse Vector Laboratories BA-2000
VECTASTAIN ABC Kit (Standard) Vector Laboratories PK-4000 1.5 mg
Staining dish for floating sections HistoTools 10009 12 x 65 mm
Staining transport basket HistoTools 10012 large
(fits 12 x 65 mm dish)
Triton X-100 Fisher Scientific P8514B N/A
DAB Fisher Scientific AC11209-0050 N/A

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References

  1. Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
  2. Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
  3. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
  4. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).

Comments

2 Comments

  1. I am very interested in performing immunohistochemistry experiments in aged monkey brains. However, preliminary tests have shown very high endogeneous (lipofuscin??) autofluorescence in the tissue. Is there an effective way to get rid of autofluorescence in a manner that preserves the tissue for IHC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Sergio,

    Here is a protocol used in my former lab with quite a bit of success:

    Reagent:
    70% (v/v) Ethanol containing 1% (w/v) sudan black B (stirred in the dark for ² h)

    Method
    1. Use a standard immunochemical staining protocol.
    ². Apply the reagent prepared above for 10 min at the step before incubation with the reagent conjugated to the fluorochrome.
    3. Quickly rinse the slides ten times in TBS or PBS.
    4. Continue with the immunochemical staining protocol.

    Hope this helps. Let me know how it turns out for you.
    Good luck,
    SZ

    Reply
    Posted by: Shahin Z.
    May 3, 2010 - 3:40 PM

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