全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

Biology

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Summary

全体の霊長類の脳で標的タンパク質の大規模な免疫検出は、任意の時点で複数のフリーフローティングセクションのバッチ染色のための創造的な装置の使用を組み合わせる方法を埋め込み、セクションなどの新たな組織を採用することで可能です。

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Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain. J. Vis. Exp. (29), e1286, doi:10.3791/1286 (2009).

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Abstract

免疫組織化学(IHC)は、標的タンパク質の検出のための最も広く使用されている実験手法の一つです。

Protocol

Immunohistochemistyは、様々な実験動物モデルの脳内におけるタンパク質発現を特徴づけるための最も広く使用されている技術の一つです。同様の脳の大きさを持つ齧歯類や他の一般的な実験モデルの脳で体系的免疫組織化学的手続を実施するのは比較的簡単です。しかし、全体のサルの脳でそのような免疫検出の手順を実行する方法の包括的な報告を提供する我々の知識への公開作品はありません。以下は、様々な標的タンパク質の大規模な免疫組織化学的検出のために全体のサルの脳を準備する方法の詳細な説明です。この作品は、商用および学術的努力とのコラボレーションの結果として浮上している。このように、埋め込み、切片組織に関する詳細は、NSAの独自の知識のまま。

パート1:動物の治療や組織の準備

成人のベルベットモンキー( ミドリザル )から脳を、本プロトコルに使用されます。すべての手順は、生物医学研究1の動物の利用とケアのためのアニマルケアに関するカナダの協議会(CCAC)ガイドラインに準拠して行われている。

  1. 動物は深く、(10 mg / kgを、IM)塩酸ケタミンで鎮静ペントバルビタールナトリウムの過剰投与(25 mg / kgを、IV)を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流される。
  2. これは、5分(〜1リットル)のためのPBS中4%パラホルムアルデヒド溶液が続いている。
  3. 脳は、容器の底に沈む˚Cまで、外部化された脳は、0.02%アジ化ナトリウムを含む段階的PBS -バッファショ糖溶液(シーケンス10、20および30%)に入れ、4に維持される。脳は、凍結切片を経るまでのソリューションは、数日おきに置換されます。
  4. 彼らの独自のMultiBrain™埋め込みおよび凍結セクショニング技術に供される、脳が神経科学アソシエイツ(ノックスヴィル、テネシー州NSA)に送信されます。
  5. セクションが適切な方向になる(すなわち、左から右方向)と組織学的処理後に再整列できるように、7(7)アライメントマークを埋め込むマトリックスに配置されます完了です。
  6. 各シリアルセクションがブロックから収集される前に凍結ブロックは、デジタルブロック面で撮影されています。デジタル画像だけでなく、この脳からのセクションは、それぞれ後、解剖学的および組織学的マップの3D再構成のために使用することができます。
  7. シリアルフリーフローティング冠状セクション、セクションごとに50μmの厚さで、脳全体から収集されます。

第2部:組織学的処理

セクションは、与えられた空間の間隔で選ばれている(例えば、500μm)と我々の実験目的のために以下の抗体で処理した:脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP、ケミコン、テメキュラ、カリフォルニア州)、SMI32(シュテルンベルガーモノクローナル抗体(株);ボルチモア、MD)、およびNeuN(ケミコン、テメキュラ、カリフォルニア州)。 FMRPは豊富に正常と順列キャリアの脳の神経細胞2に見られる細胞質タンパク質である。 NeuN(神経核)は、特にほとんどのニューロンに存在し、神経核、perikaryonの複数形といくつかの近位の神経のプロセス3で配布されているDNA結合ニューロン特異的タンパク質のNeuNを認識します。 SMI - 32は、ニューロフィラメント蛋白質4の非リン酸化エピトープを認識するモノクローナル抗体である。

  1. 500μmの間隔で、約140のセクションは、抗体ごとに使用されています。
  2. すべてのインキュベーション、洗浄および染色ステップは、特殊な染色皿やバスケット(;ノックスヴィル、テネシー州HistoTools)を用いて軽く攪拌しながら実施されています。
  3. セクションは、最初の抗体分子の非特異的結合と、その結果、バックグラウンド染色を低減するために、0.1 M PBS/0.3%トリトンX - 100(TX)/ 60分間5%正常しわがれ血清(NHS)を含む溶液中でインキュベートする。
  4. ベンダーの指示に従って、FMRPの免疫染色用にマークされたセクションでは、抗原のアンマスキングソリューション(バーリンゲーム、カリフォルニア州ベクトルラボ)を使用して、抗原回復の追加のステップを経る。
  5. セクションは、NeuN抗体について(1 / 5の希釈率で、FMRPとSMI - 32と1 / 2、000の000、0.1 M PBS/0.3%TX / 3%NHSを含む、それぞれの抗体溶液中で一晩とは別の日にインキュベートされる。
  6. 1 /;次の日は、セクションは馬で提起されたビオチン化抗マウス二次抗体で室温で2時間インキュベートした洗浄液で3つの10分の期間(0.1 M PBS/0.3%TX)(ベクター研究所のために洗浄されています0.1 Mの1,000倍希釈PBS/0.3%TX / 3%NHS)。
  7. 3 10分間の洗浄のさらなるセットの後、切片を室温で1時間アビジン - ビオチン結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(ベクター研究所)の溶液中に配置されます。
  8. 最後に、洗浄の別のセットの後、切片をニッケル強化された径に10分間さらされているminobenzidine(ニッケルDAB)免疫反応性ニューロン内の染色ダークブルーを生成する反応。
  9. 組織学的手順の完了時に、セクションは、ゼラチンコートしたスライドガラス上にマウントされています。
  10. すべてのセクションでは、一晩風乾しており、標準的な手順に従って封入。

パート3:代表的な結果:

このメソッドは、全体のサルの脳全体の関心の標的タンパク質の完全な発現プロファイルを生成します。ここではFMRP、NeuNと同じサルの脳内SMI32式のスナップショットを提供する代表的な冠状セクションを示しています。

図1:免疫検出のためのフリーフローティングセクションの大規模なバッチ処理に使用される染色皿()とバスケット(B)。

図2:FMRP()、NeuN(B)とSMI32(C)抗体で染色ベルベットモンキーの脳からの代表的な冠状断面。

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Discussion

可能な限り全体のサルの脳内のタンパク質の大規模な検出を行うこの手順の2つの重要なステップがあります。一つは、NSAの独自の知識のまま埋め込むとセクショニングのプロトコルです。他はHistoToolsで提供される染色料理やバスケットを使用することです。後者は、所定の時間に多くの(〜40)のセクションの容易かつ迅速な処理を行うことができます。また、一様に脳全体のすべてのセクションを治療するための手段を提供し、科学的に健全な組織学的治療になります。さらに、埋め込まれたランドマークの使用は、デジタル乾燥や封入スライドからの染色パターンを取得するために、分析のさまざまな形式にデジタル化されたファイルを施すことができるという付加的利点を提供します。我々は3つの抗体の例を提供しますが、この手順は、特に他の標的タンパク質だけでなく、組織学的染色の広い範囲、細胞構築、様々な皮質領域を明らかにし、それゆえマッピングの目的で使用されるものに適用することができます。

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Acknowledgments

私たちは、霊長類の仕事の継続的なサポートのために、フランクエルヴィン、ロバータパーマー、セントキッツ、西インド諸島に位置する行動科学財団研究所のスタッフに感謝しています。ヘルスリサーチ(AC)とナショナルエンジニアリングとカナダの研究評議会(MP)のカナダの協会からオペレーティング助成金 - この作品は、カナダの脆弱X研究財団(FXRFC)からSZの親睦とによってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-FMRP monoclonal antibody Chemicon International MAB2160 Requires antigen retrieval in fixed tissue.
anti-NeuN monoclonal antibody Chemicon International MAB377 N/A
anti-Neurofilament H monoclonal antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI32 N/A
Antigen Unmasking Solution Vector Laboratories H-3300 N/A
Normal horse serum Invitrogen 16050122 500 mL
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse Vector Laboratories BA-2000
VECTASTAIN ABC Kit (Standard) Vector Laboratories PK-4000 1.5 mg
Staining dish for floating sections HistoTools 10009 12 x 65 mm
Staining transport basket HistoTools 10012 large
(fits 12 x 65 mm dish)
Triton X-100 Fisher Scientific P8514B N/A
DAB Fisher Scientific AC11209-0050 N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
  2. Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
  3. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
  4. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).

Comments

2 Comments

  1. I am very interested in performing immunohistochemistry experiments in aged monkey brains. However, preliminary tests have shown very high endogeneous (lipofuscin??) autofluorescence in the tissue. Is there an effective way to get rid of autofluorescence in a manner that preserves the tissue for IHC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Sergio,

    Here is a protocol used in my former lab with quite a bit of success:

    Reagent:
    70% (v/v) Ethanol containing 1% (w/v) sudan black B (stirred in the dark for ² h)

    Method
    1. Use a standard immunochemical staining protocol.
    ². Apply the reagent prepared above for 10 min at the step before incubation with the reagent conjugated to the fluorochrome.
    3. Quickly rinse the slides ten times in TBS or PBS.
    4. Continue with the immunochemical staining protocol.

    Hope this helps. Let me know how it turns out for you.
    Good luck,
    SZ

    Reply
    Posted by: Shahin Z.
    May 3, 2010 - 3:40 PM

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