Mus Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Adrenal medullär chromaffin cellodling system är mycket användbara för studier av excitation-sekretion koppling i en in vitro miljö. Detta protokoll illustrerar den metod som används för att dissekera binjurarna och sedan isolera medullär regionen genom strippa bort binjurebarken. Den nedbrytning av medulla i enskilda chromaffin celler är då påvisas.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kolski-Andreaco, A., Cai, H., Currle, D. S., Chandy, K. G., Chow, R. H. Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation. J. Vis. Exp. (2), e129, doi:10.3791/129 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adrenal medullär chromaffin cellodling system är mycket användbara för studier av excitation-sekretion koppling i en in vitro miljö. Detta protokoll illustrerar den metod som används för att dissekera binjurarna och sedan isolera medullär regionen genom strippa bort binjurebarken. Den nedbrytning av medulla i enskilda chromaffin celler är då påvisas.

Protocol

Förkortningar:
ACC - Adrenal Chromaffin Celler, E. lösn. - Enzyme lösning, E. DMEM - Berikade Dulbecco ändrade Eagle Medium

  1. Förberedelser
    1. Lägg papain till önskad mängd E. lösn. (40 enheter papain / 1ml E. lösn..).
    2. Aktivera papain med carbogen i ca 15 minuter på is. Syresätter Lockes buffert på is också.
  2. Dissection
    1. Använd 8-10 vecka mus.
    2. Rötningen bort syresatt Lockes buffert och placera på is.
    3. Se video för dissekering förfarande.
    4. När exciderad, syresatt plats körtlar i Lockes buffert.
  3. Beredning av Gland
    1. Ta bort fett från körteln.
    2. Strip cortex från körteln.
  4. Enzymatisk spjälkning
    1. Sterilfilter syresatt papain.
    2. Gör fyra pooler av syresatt papain på en petriskål.
      1. 3 pooler bör vara ca 100uls.
      2. 1 av poolerna bör vara ca 400uls.
    3. Tvätta medullae genom pooler
      1. 1:a genom 3 100ul pooler.
      2. Sedan genom 400ul poolen
      3. Pippette 300ul E. lösn. och märgen bitar från 400ul pool i mikrofugrör.
      4. Qrap parafilm på mikrofugrör och placera i 37 ° C vattenbad i 20min.
      5. Kom ihåg att fortsätta att syresätta återstående E. lösn. innehåller papain.
      6. Efter 20 minuter sterilfilter mer E. lösn..
      7. Byt ut gamla E. lösn. bad medullae med nyligen filtreras E. lösn..
  5. Trituration
    1. Aspirera och kassera E. lösn..
    2. Tvätta medullae i 1 ml E. DMEM.
    3. Aspirera och kassera E. DMEM.
    4. Lägg 300ul E. DMEM och mal sönder 20X med 1ml spets.
    5. Skär 200ul spets med steril rakblad.
    6. Mal sönder 5-10X med avskurna 200ul spets.
    7. Kasta E. DMEM bitar bad medullae. Medel kommer att innehålla skräp.
    8. Lägg 300uls färska E. DMEM till medullae bitar.
    9. Mal sönder med 200ul spets 20x
    10. Pippette E. DMEM att mikrofugrör withough medullae bitar. Medel kommer att innehålla fri ACC.
    11. Lägg 300uls färska E. DMEM till medullae bitar.
    12. Mal sönder medullae med 23,5 gauge sprutnålen 20x.
    13. Kombinera E. DMEM från båda trituration. Medullae bitar bör inte vara närvarande och ska nu ha en featherlike utseende.
  6. Plating
    1. Mikrofugrör E. DMEM från de senaste två trituration stegen för 2,5 minuter på 3.7g s.
    2. Resuspendera pelleten i 50uls-200 E. DMEM, beroende på efterföljande experiment.
    3. Plate 10-30uls på ett glas täckglas.
    4. Vänta 15 minuter för celler att hålla sig.
    5. Lägg 750uls av E. DMEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 27, 2007 - 11:27 AM
  2. Nice and clear video! What is the reason that the Locke's has to be oxygenated? In 4.1 you talk about oxygenated papain, dŒ you mean here (and in other points) carbonated? Can the E. Soln also be buffered with Hepes, why dŒs it has to be carbonated? Thanks in advance!   Cheers, Tony

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2008 - 8:24 AM
  3. I would like appreciated receiving the protocols to obtain adrenal chromaphin cells

    Reply
    Posted by: Asunción C.
    April 29, 2013 - 9:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics