Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In dit protocol beschrijven we het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) om hoge-resolutie afbeeldingen van actine dynamiek vast te leggen in PtK1 cellen. Een uniek voordeel van FSM is de mogelijkheid om de beweging en de omzet kinetiek (montage / demontage) van de F-actine-netwerk vast te leggen in levende cellen. Deze techniek is vooral handig bij de afleiding van kwantitatieve metingen van F-actine dynamiek wanneer gecombineerd met computer vision software (qFSM). We beschrijven de selectie, micro-injectie en visualisatie van fluorescerende probes actine in levende cellen. Belangrijk is dat soortgelijke procedures zijn van toepassing op het visualiseren van andere macomolecular assemblages. FSM is aangetoond voor microtubuli, intermediaire filamenten, en hechting complexen.

Protocol

Deel 1: Het verkrijgen van uw fluorescent gelabelde actine voor FSM

Materialen die nodig zijn: gezuiverd actine, fluorofoor (Alexa, X-rhodamine aanbevolen). G-buffer, ultracentrifuge

  1. Een belangrijk onderdeel voor het verwerven van een goede FSM films is de juiste etikettering van actine (of andere cytoskeleteiwitten) met de fluorofoor van uw keuze.
    Wij raden u aan fluoroforen van Alexa (488, 568 golflengten) en X-rhodamine succinimidylester derivaten die lysineresiduen richten blootgesteld op het oppervlak van actine.
  2. Bij de keuze van uw fluorofoor en de juiste golflengte, zorgen ervoor dat uw microscoop instellen van de juiste filters (excitatie en emissie) en illuminatoren heeft (kwik booglamp en / of lasers) om je fluorescerende tag tegemoet te komen. We raden u aan golflengten in het oranje naar rood golflengten (560-630 nm) om de effecten van auto-fluorescentie en foto-schade te minimaliseren en de verenigbaarheid ervan met GFP-conjugaten te verzekeren.
  3. Pure actine kan worden gewonnen uit het spierweefsel die behoren tot Rat of kip, maar vereist een langdurige extractie-procedure van de spieren aceton poeder. Muscle aceton poeder kan worden gekocht van Invitrogen. De etikettering procedure is niet besproken in dit protocol, maar kan hier [1] te vinden
  4. Als alternatief kunt u de aanschaf gelabelde actine eiwitten van verschillende leveranciers waaronder cytoskelet Inc, en Invitrogen. Aangepaste etikettering diensten zijn ook beschikbaar via Invitrogen. Gezuiverd, niet-gelabelde actine (zowel spier-en nonmuscle actine) kunnen worden gekocht bij cytoskelet Inc
  5. Of u besluit tot aankoop van of bereid uw eigen label actine, wilt u ervoor zorgen dat de etikettering verhouding ergens rond de 0,3 tot 0,7 kleurstoffen per monomeer van actine. Een te hoge ratio kan een etiket invloed op de omzet kinetiek (en de binding aan geassocieerde eiwitten) van het actine filament, terwijl een te lage etikettering verhouding zal leiden tot slechte zoek spikkels (lage signaal-ruis) en kan leiden tot micro-injectie problemen (zie hieronder). Dit is een kritieke factor voor het krijgen van goede spikkel beelden.
  6. Voorafgaand aan de lange termijn opslag, moeten de gelabelde actine oplossing worden verduidelijkt door het draaien op 75.000 - 80.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 graden Celsius. Label actine moeten worden bewaard in G-buffer-oplossing en bleef -80 graden Celsius. Bereiding van 2 uL monsters wordt sterk aangeraden om de schadelijke effecten van herhaalde invriezen-ontdooien (leidt tot onoplosbare aggregaten) te verminderen. Zich te onthouden van het blootstellen van de gelabelde actine oplossing voor direct licht (wordt fotobleken van fluoroforen). Wij raden u aan ondoorzichtige microcentrifugebuizen voor langdurige opslag.

Deel 2: Voorbereiding van cellen en micro-injectie van gelabelde actine

Materialen die nodig zijn: micro-injectie naalden, injectiespuit, microloaders, voorverwarmde cel media, injectie buffer, emmer ijs, microscoop (fase-ring-, fase-contrast objectief 40X, Transjector, naald puller, micromanipulator)

  1. Veel soorten cellen vatbaar zijn voor FSM, maar het krijgen van goede speckle beelden is direct afhankelijk van het succes van de micro-injectie procedure. Bij het selecteren van cellen voor de FSM, cellen moeten groot (> 50 um in diameter), moet verspreid wanneer verzilverd, en worden natuurlijk aanhanger aan substraten (of plastic weefselkweek gerechten). Het helpt ook als de cel cytosol beslaat een oppervlakte groter is dan de kern. De bovengenoemde criteria ervoor zorgen dat cellen vatbaar zijn voor micro-injectie. Geslaagde kandidaat cellijnen omvatten (maar niet beperkt tot) PtK1 [2,3], newt longcellen [4], en Aplysia neuronen [3].
  2. De cellen moeten worden uitgeplaat op vierkante glazen dekglaasjes (22 x 22 mm;. Geen 1-1/2) die zijn zuur gewassen. Standaard substraat coating kan worden toegepast op het dekglaasje en heeft geen invloed op micro-injectie.
  3. De juiste keuze van micro-injectie naalden is afhankelijk van de grootte van de tip opening. Typisch, gat afmetingen kunnen zeer in grootte van 0,5 um tot zo groot als 3 um. Wij adviseren echter dat de injectie van actine vereist een optimale opening grootte tussen 0,5 en 1 uM. Als verstopping problemen consequent aangetroffen, kan groter gat maten geschikt voor de levering van monomere als ongewenst gepolymeriseerde actine filamenten. Micro-injectie naalden kunnen worden aangeschaft via verschillende leveranciers waaronder Eppendorf systemen die femtotip micro-injectie naalden te maken. Als alternatief indien een commerciële naald trekker beschikbaar is, kunnen micro-injectie glazen buisjes gekocht van Sutter, en trok de specificatie. Voor beginners raden wij met 10-20 trok naalden bij de hand voordat u begint met de injectie procedure.
  4. Ideal 'injectie concentratie "(uiteindelijke concentratie van actine geladen in de naald) van actine is tussen 0,5 en 1,0 ug / ul op basis van een 40% verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeer. Lagere etikettering verhouding van uw actine kan worden gecompenseerd door het injecteren van bij hogere concentraties (1-3 ug / ul). Echter, de verstopping frequentie van uw naaldworden verhoogd. Dit kan gedeeltelijk worden verminderd door gebruik te maken naalden met grotere openingen. Stock concentratie van actine kan worden verdund door de toevoeging van ijskoude injectie buffer. Ijskoude ddH2O kan ook gebruikt worden om te verdunnen voor een snelle injecties. Op dit punt alle werkende oplossingen moeten worden bewaard op ijs.
  5. Belasting 0,5 tot 1,0 uL van uw actine-oplossing met behulp van een micro-injectiespuit (smalspoor - Hamilton), of anders met behulp van een pipet microloader tip.
  6. Voorzichtig afzien van het actine-oplossing, door voorzichtig het vrijgeven van de oplossing. Bubbles moeten worden vermeden, maar kunnen eenvoudig verwijderd worden door het nemen van overtollige vloeistof rond de bubble.
  7. Zorg ervoor dat de actine-oplossing volledig rusten op de naald. Overtollige oplossing ergens langs de capillaire van de naald kan verstoren de injectie flow.
  8. Nu, voorzichtig bevestig de naald, het vermijden van contact met de naald naar de injector houder. Plaats de houder zo dat de naald maakt een 35-50 graden aan de basis van de microscoop podium. Lagere hoeken hebben de voorkeur.
  9. Laat de punt van de naald tot het nauwelijks breekt het oppervlak van de media baden van uw cellen.
  10. Nu de positie van de naald (zonder te verlagen), zodat het rust direct boven het midden van de doelstelling. Als de naald op een lijn met de doelstelling, moet je een heldere halo zien door het oculair. Dit is het einde van de naald komt. Langzaam de naald van links naar rechts (met de manipulator) kan beter te helpen bij het opsporen van de halo.
  11. Stel de z-focus op de microscoop totdat je cellen zijn in zicht. Nu, langzaam de tip tot aan de halo geleidelijk vernauwt totdat uiteindelijk samenkomen in de punt van de naald - u moet de focus (z-positie) tegelijkertijd te controleren. Een extra functie om te zoeken naar is de as van de naald, die zal werpen lineair schaduwen. Het verlagen van de naald zal geleidelijk bepalen de naald as. Wanneer correct aan het einde van de naald en je cellen gedaan, moeten beiden in zicht. Kleine aanpassing van de fase-ring kan nodig zijn om het contrast te verbeteren.
  12. Tijdens het navigeren, zorgen voor de top van de naald ver boven je cellen om te voorkomen dat het breken van de naald.
  13. Bij het selecteren van cellen te injecteren, moeten cellen met vrije randen worden geconfronteerd met de naald. Dit zal zorgen voor dalende helling van de cel (uit dikste punt, waar de kern, woont op het dunste punt van de leading edge) zal de naald, in plaats van parallel te ontmoeten.
  14. De naald druk moet worden vastgesteld op 0,3 tot 0,8 psi. De toegepaste constante druk zal resulteren in een gestage stroom van het actine-oplossing.
  15. Na de beslissing op een cel te injecteren, de positie van uw naald dus de tip is naast de kern (perinucleaire regio, dikste deel van de cel waar de kern is niet direct onder).
  16. Langzaam naar beneden, en stel de positie van de naald tot de top is het indrukken van de membraan, die nu stapsgewijs verlagen tot de naald tip heeft doorboord het membraan. Als de naald volledig doorboord het membraan, zal de cel helderder, zodra je ziet dit verschil te verhogen de naald totdat het niet langer aanraken van de cel. De werkelijke piercing en het injecteren van proces duurt 0,5 tot 2 seconden.
  17. Wanneer correct gedaan, zal de cel vorm onveranderd lijken, terwijl te veel injectie zal resulteren in een snelle terugtrekking van de cel rand en in sommige gevallen zul je eigenlijk zien de cel exploderen.
  18. Als u geen veranderingen zien in de cel toen microinjecting (niet helderder), kan de naald worden gesloten. U kunt dit testen door op de 'schone' knop indien beschikbaar op uw Transjector. Indien open, zal dit significante toename van de constante druk stroom die kan worden gezien door de oculairs - het zal verschijnen als rimpelingen en in de buurt puin kan worden gezien verstuiven.
  19. Als de naald is gesloten, kunt u ervoor kiezen om een ​​nieuw micro-injectie naald of poging om de punt van de naald breken door voorzichtig het verlagen van de naald tot aan de punt van de naald drukt tegen de glazen dekglaasje te voegen, waardoor de aan het einde van de tip te breken. De breuk gebied moet niet meer dan een 1 / 5 e van het oppervlak van de naald punt (het deel van de naald die begint te convergeren naar een punt).
  20. Ga verder met de injectie, besteden niet meer dan 20 - 45 minuten voor elke micro-injectie sessie (afhankelijk van type cel). Als algemene regel geldt, zijn kortere sessies aan te raden om stress te minimaliseren op cellen.
  21. Na het afronden van de micro-injectie, wijzigt u de cel media in de schotel door het toevoegen van verse voorverwarmd media. Laat vervolgens cellen te herstellen gedurende 30 minuten in een incubator voor de beeldvorming. Dit zal ook zorgen voor de actine te integreren in het bestaande netwerk cytoskelet.

Afdeling 3: Montage van de Imaging Kamer

Benodigde materialen: dekglaasje, dubbelzijdig tape, q-tips, tang, valap, kim vegen, oxyrase, imaging media, scheermesje, P200 piPette, pure ethanol

  1. Begin met het voorverwarmen van de imaging media en ontdooien een 15 uL hoeveelheid van Oxyrase. Zorg ervoor dat de lichtgevoelige oxyrase bescherming tegen licht. De toevoeging van oxyrase zal sterk verminderen van de effecten van fotobleken.
  2. Voorverwarmen van de valap, door het instellen van de hete plaat temperatuur laag. Niet oververhitten / branden van de valap want het zal zijn werkzaamheid als een kit te verliezen.
  3. Veeg een dekglaasje met een kimwipe overgoten met zuivere ethanol te reinigen en te verwijderen kleine rommeltjes.
  4. Stapel twee even grote lengtes (2,5 cm lang) van de dubbelzijdige tape op de top van elkaar, met behulp van een schone vlakke ondergrond als een platform. Druk op eventuele luchtbellen om een ​​volledig plat vlak te creëren.
  5. Met behulp van een scheermesje, twee rechte stroken afgesneden langs de lange as, zodat elke strook 0,5 cm in de breedte maatregelen.
  6. Met behulp van een tang, elke strip dus plaats tegen de lange zijde van het dekglaasje dat de twee stroken tape een gat in het midden van je dekglaasje creëert. Druk zachtjes op de band een mooie zegel met het glas te maken. De strips van de band zal optreden als afstandhouders tussen de dekglaasje en het dekglaasje.
  7. Zorg ervoor dat de valap volledig vloeibaar voordat u begint met de volgende stap.
  8. Haal uw voorverwarmd imaging media, het toevoegen van 15 ul van oxyrase voor elke 500 ul van de media.
  9. Vouw kimwipes in driehoeken tot en met 3 harde randen te creëren. Dit zal worden gebruikt om een ​​droog oppervlak voor de band te creëren om te kleven.
  10. Ophalen cellen van de incubator. Met behulp van pincet, pak een hoek van het dekglaasje. Plaats snel de dekglaasje op een kimwipe (cel zijde is naar boven, niet aanraken van de weefsel), en gebruik de gevouwen kimwipe om twee tegengestelde kanten van het dekglaasje vegen om een ​​semi-droge ondergrond te creëren (op het oppervlak waar uw cellen rust).
  11. Met behulp van pincet, pak een hoek van het dekglaasje en plaats het op je dekglaasje, zodat de droge oppervlakken worden afgestemd op de twee stroken van de tape. Merk nu heb je twee gesloten en twee open zijden spleten. Langzaam pipet 200 uL van uw imaging-media-oxyrase oplossing dicht bij een opening. Belangrijk is, mag er geen luchtbellen worden ingevoerd. De oplossing dient te worden opgezogen in de nieuw samengestelde kamer door capillaire krachten, dus volledig je cellen onder te dompelen in een oplossing.
  12. Met behulp van een Q-tip schar de vier hoeken van uw dekglaasje met gesmolten valap om snel te brengen en te stabiliseren het dekglaasje. U zult merken dat de valap droogt direct (binnen enkele seconden bij kamertemperatuur).
  13. Nu beginnen met de open zijden (niet-tape kant), lag een dunne strook van valap met behulp van een Q-tip en het nabootsen van een borstel beroerte. Herhaal dit voor de gesloten zijkanten. Langzaam opbouwen van de vacht van valap, waardoor de versterking van de afdichting door het herhalen van de coating stappen. De valap moet worden beperkt tot de randen, waardoor het centrum van het dekglaasje duidelijk.
  14. Reinig het middelste gedeelte van het dekglaasje met behulp van een Q-tip met ddH2O om eventuele resten van de media te verwijderen, die bewust niet naar de cellen te vernietigen. Herhaal stap reinigen met zuivere ethanol.
  15. Je hebt nu een volledig gesloten imaging kamer geoptimaliseerd voor spikkel beeldvorming. Het hebben van een volledig verzegelde behuizing voorkomt dat uw fluoroforen van snel fotobleken.

Deel 4: Imaging cellen

Materialen die nodig zijn: omgekeerde groothoek microscoop, mecury lamp, passende filters, gekoelde CCD-camera met 6,7 micron pixels, hoge numerieke apertuur, olie-immersie plan-apochromatische doelstellingen (60X tot 100X, fase of DIC). Triltafel. Imaging software.

  1. Voorverwarmen van de microscoop etappe naar 37 graden. Plaats uw nieuw opgeleverde imaging kamer, en wacht 10-15 minuten voor de temperatuur te stabiliseren alvorens beeldvorming.
  2. Begin door te focussen uw cellen in Bright-veld, en dan je ingespoten cellen te vinden door te drukken op de juiste fluorescentie-instellingen. Probeer het moment van de fluorescentie blootstelling te verminderen fotobleken te minimaliseren.
  3. Kijk voor geïnjecteerde cellen die gezond gebogen leading edges te hebben. Over-geïnjecteerde cellen (explodeerde cellen) wordt gekenmerkt door ingetrokken en gekartelde randen, die lijkt op een groot aantal filopodia - te vermijden imaging deze cellen.
  4. Overname instellingen hangt af van het celtype, de kwaliteit van de gelabelde actine, en microscoop componenten. Echter, moet de blootstelling instellingen niet groter zijn dan 2 seconden, en de tijd tussen twee frames moet worden ingesteld tussen de 5 en 10 seconden. Typische lengtes voor een tijdreeks (per afgebeeld cel) kan ergens tussen de 10 tot 30 minuten variëren, en wordt beperkt door fotobleken effecten. Gain-instellingen op de camera kan worden gedraaid om het signaal te verhogen tot ruis.
  5. Ideaal spikkel kenmerken moeten elk speckle verdeeld door ~ 2 speckle diameters naar de volgende naburige speckle. Dit zal garandeert optimale ruimtelijke en temporele bemonstering van het actine structuur. Voor de epitheelcellen, zal het gespikkelde actine-netwerk verschijnen homogeen, met spikkels gelijkmatig gespreid. Cellijnen die dicht stress-vezels of lamellipodia functiezullen worden onderscheiden, maar zal een gestippelde / gespikkeld uiterlijk hebben. Belichtingsinstellingen worden aangepast om de beste gespikkelde beelden te krijgen.
  6. Over-gemicroinjecteerd cellen zullen dicht op elkaar gepakt spikkels die niet lijken te zijn discreet. Stress vezels en de lamellipodia verliest zijn gestippeld uiterlijk.
  7. Onder-gemicroinjecteerd cellen zal zeer zwak weergegeven door het oculair, met spikkels, die ver van elkaar (> 10 spikkels van elkaar) en verschijnen willekeurig verspreid. Stress vezels en de lamellipodia in deze cellen worden onderscheiden.
  8. Sleutel tot het verkrijgen van 'goede' speckle films is focus behouden. Dit is vooral van belang voor post-analyse met speckle flow en de omzet metingen. Daarmee de kwaliteit van de kwantitatieve analyse zal afhangen van vergrendeling in de focus voor de duur van de time-lapse. Dit kan vooral moeilijk als de beeldvorming vliegtuig is heel dun. Andere factoren zal afhangen van de stabiliteit van de microscoop systeem, met name het podium behuizing en de beeldvorming kamer. Contrast-based scherpstellen kan worden gebruikt als afbeelding interval lengtes voldoende zijn om deze functie te passen. Andere opties zijn de aankoop van een nabij-infrarood gebaseerde focus systeem dat een betrouwbare real-time scherpstelling biedt. U vindt deze aanbiedingen van Nikon, Olympus en ASI.

Deel 5: qFSM analyse

Deze sectie is niet in detail besproken, maar de informatie over de analyse-software kunt u hier [5] te vinden. Software download verzoeken kunnen worden gemaakt op onze website (lccb.scripps.edu).

Onderwerpen die:

  • Geluid kalibratie
  • Speckle detectie
  • Volgen met behulp van een hybride aanpak van beeld correlatie-based tracking van de grove beweging van spikkel gebieden en enkel deeltje het volgen van de gedetailleerde beweging van de individuele spikkels.
  • Berekening van het polymeer montage en demontage tarieven van de intensiteit schommelingen tijdens speckle verschijnen en verdwijnen evenementen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een aantal belangrijke factoren van cruciaal belang zijn voor het succesvol behalen van spikkel beelden, hoe goed spikkels beginnen en eindigen met de kwaliteit van uw fluorescent gelabelde actine. Een hoge verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeren, die rond 0,4 tot 0,7 zal ervoor zorgen dat spikkels zal verschijnen helder en discreet, terwijl de gelabelde eiwit zelf moet oplosbaar en vrij van aggregaten. Even belangrijk is de micro-injectie procedure. Om ervoor te zorgen normale cel homeostase (en overleving), de cellen moeten worden geïnjecteerd met een lage waterdruk, de invoering van een lage concentratie van gelabelde eiwitten. Dit vereist een zekere mate van technische kennis / ervaring met betrekking tot het gebruik van het micro-injectie-systeem. Als algemene regel geldt, kortere injectie tijden (<1s) de voorkeur over een langere injectie tijden. De laatste cruciale component is de microscoop. Een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een kwik-lamp epi-illuminator, gevonden in de meeste kernfaciliteiten, zal dienen als een geschikt platform voor spikkel beeldvorming. Ervan uitgaande dat de juiste fluorescentie filters op hun plaats, de combinatie van een hoge NA doelstelling en een gekoelde CCD-camera met hoge resolutie beelden van heldere vlekken te produceren. Wij raden u aan een sterke vergroting (100X), hoge NA (> 1.3), plan-apochromat doelstellingen die een superieure resolutie en helderheid zal bieden. Onder ideale omstandigheden injectie, kan de vergroting worden verlaagd tot 60X, het verhogen van de helderheid en SNR per pixel. Lage ruis, hoge quantum efficiënte, gekoelde CCD-camera's, met een pixel grootte van ~ 6,5 micron zijn ideaal detectoren, en in sommige gevallen kan compenseren voor de slechte kwaliteit fluorescerende probes. Bovendien kan fluorescent gelabelde eiwitten probes worden co-geïnjecteerd met cDNA constructen (nucleoinjection) tot uitdrukking te brengen GFP / RFP geconjugeerde eiwitten binnen dezelfde cel. Dit vereist de nucleoinjection van cDNA in de kernen van cellen, gevolgd door een tweede injectie in de omringende cytoplasma. Samengevat, FSM biedt ongekende inzichten in cytoskelet dynamiek. Het verkrijgen van een goede spikkels vereist de juiste probes, apparatuur en een beetje geduld (opleiding).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De ontwikkeling van qFSM wordt gefinancierd door de NIH subsidie ​​U01 GM06230.

Materials

Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C

G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercapt–thanol

Store up to 1 day at 4° C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
  2. Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
  3. Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
  4. Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
  5. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics