인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

Biology

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Summary

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연 (부분 II : 인간 아일 레츠의 정화 및 문화)에 대한 절차를 수정 자동화된 방법을 사용하여.

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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

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Abstract

1 형 당뇨병의 관리는 매년 100여 억 달러를 비용, 모두 개인과 사회에, 부담합니다. 포도당 모니터링 및 새로운 인슐린 공법의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 사람은 여전히​​ 파괴적인 보조 합병증을 개발합니다. 췌장 아일릿 이식은 당뇨병 환자에서 정상적인 혈당 조절 근처에 복원할 수 있습니다

Protocol

1. 아일 레츠의 정제

  1. 아일릿 정화 절차를 시작하려면, COBE 가방을 읽어 녹색 튜브를 제외한 모든 튜브 클램프, 0로 1,500 속도를 설정하고 슈퍼.
  2. 후드에는 펌프와 그라디언트 비커를 설정하고 녹색 튜브에 수집 튜브를 연결합니다.
  3. "회전"은 다음 앞에 비커에 Ficoll 1.100 110 ML을 추가 푸시하고, COBE 가방을로드하기 위해 펌프를 시작 이제 ficoll 1.100의 로딩이 시작할 수 있습니다. Ficoll이로드되면서, 슈퍼를 눌러 펌프를 정지, 펌프​​ 헤드를 unclamp 100에 슈퍼 제한 속도를 설정합니다.
  4. ficoll이 비커에 도달하고 모든 공기가 펌프 헤드에서 튜브, 다시 클램프에서 퇴학 경우. 3000 회전 속도, 그리고 슈퍼 아웃 속도 0으로 설정합니다.
  5. 지금은 전면 비커에 무거운 그라디언트를 따르고하여 그라디언트를 로드할 준비합니다. 약간 모든 공기를 제거하는 두 비커 사이의 클램프를 놓습니다. 그런 다음 다시 비커에 빛을 그라데이션을 따라줘.
  6. 자기 활동가 켜고, COBE 기계에 "스핀"을 누르 두 비커를 연결하는 튜브의 클램프를 제거하고, 시각적으로 무겁고 가벼운 그라디언트가 혼합되어 있는지 확인합니다.
  7. 그라디언트가 혼합 시작되면, 원심 분리기를 켜십시오. 잠시만 기다려 다음 혼합 그라디언트를 로드할 수있는 펌프를 켭니다.
  8. 조직의 그라데이션이 앞에 비커에 부족하게 로드할 수 있지만, 공기가 로딩 튜브를 입력하도록 낮아 다음 비커를 연결하는 튜브를 reclamp하고 조직을로드하지 않습니다.
  9. 조직의 나머지 부분을 계속 추가합니다. 그런 다음 세척 솔루션 50 ML과 조직을 개최 튜브를 세척하고, 전면 비커를 씻어을 사용합니다.
  10. 조직의 마지막 봉투를 입력으로 동시에를 펌프를 정지 펌프 헤드에 unclamp하고, 가방 위 튜빙을 클램프. 5 분 원심 분리기로 진행합니다.
  11. 원심 분리가 계속하는 동안, 후드에 12 컬렉션 튜브를 가지고와 그 뚜껑을 느슨하게. 노란색 튜브에 수집 튜브를 부착하고, 원뿔 튜브 하나에 멸균 수집 팁 장소. 다음 노란색 튜브를 unclamp하고, 녹색 튜브 클램프.
  12. 회전이 끝나면 천천히 100 Superout을 올립니다. 튜브 1 150 ML를 수집합니다. 다음 (200-230 ML에서) 튜브 2-12에서 30 ML를 수집합니다.
  13. 일단 수집이 완료되면, COBE의 "STOP"푸시. 이제 정화는 이제 끝났어 아일 ​​레츠는 평가와 교양 수 있습니다.

2. 샘플링과 문화

  1. 정화 아일 레츠 분수를 수집 후, 12 컬렉션 튜브의 각 샘플을 제거하고 Dithizone로 얼룩. 얼룩은 레이어 낮은 순도 아일 레츠와 고순도 아일 레츠 대 레이어를 포함하는 표시됩니다.
  2. 각 함께 높고 낮은 순도 조직과 수영장를 수집합니다.
  3. 스핀과 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, 최종 와시 매체와 250 ML 각의 볼륨을 가져.
  4. 평가하려면 풀링 분수가 낮은에서 풀링된 분수 하나 하나 ML 샘플의 높은 두 한 ML 샘플을 채취하여 시작합니다. 세척 용액 9 ML을 포함하는 원뿔 관에 각각 1ml 샘플을 전송합니다.
  5. 다음 각 15 ML 관에서 계산 접시 1 ML을 전송하기만하면됩니다. 검사하고 현미경으로 세포를 계산합니다.
  6. (십진수로 아일 레츠 총 EIN / 순수) / (술병 당 30,000 EIN) : 세포가 문화를 다음 수식을 사용하여 아일 레츠를 필요 flasks의 수를 계산 카운트 후. 예를 들어, 90 % 순도로 100,000 아일 레츠 4 flasks에서 양식입니다.
  7. 37 T175 flasks 문화에 아일 레츠를 전송 ˚ C 및 5% CO 2 배양기.

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Discussion

인간 아일릿 절연의 기술에 상당한 진보에도 불구하고, 아일릿 수율이 높은 변수 및 예측 남아 있습니다. 소화 췌장 조직의 정화는 이식을위한 성공적인 효소 소화 후 충분한 이슬 미사를 복구하는 데있어 매우 중요합니다. 매우 순수한 인간 아일 레츠의 뛰어난 복구이 방법을 사용하여 입증 되었기 때문에 UIC 정화 방법을 권장합니다. 또한, 소화 조직의 최대 50 ML 따라서 격리에 사용되는 총 시간을 단축하여 인간 아일 레츠의 국소 빈혈 - 관련 부상을 최소화 정화를위한 실행 단일 Cobe에 로드할 수 있습니다.

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Acknowledgements

시카고 일리노이 대학에서 창립뿐만 아니라 지원 아일릿 세포 자원 센터 NIH 그랜트 (RFA - RR 05-003), 크리스토퍼 재단 Efroymson 재단과 Tellabs 재단으로.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

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References

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Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

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