人間の膵島単離:パートII:ヒト膵島の精製と​​文化

Biology

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Summary

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。修正された自動化された方法を使用して:このビデオでは、我々は人間の膵島の分離(ヒト膵島の精製と​​文化部II)の手順をステップバイステップで説明します。

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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

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Abstract

1型糖尿病の管理は、年間1,000億ドルで、個人と社会の両方に、厄介です。グルコースモニタリングと新しいインスリン製剤の普及にもかかわらず、多くの個人はまだ壊滅的な二次的合併症を開発する。膵島移植は、糖尿病患者における正常血糖コントロールの近くに復元することができます

Protocol

1。膵島の精製

  1. 膵島精製の手順を開始するには、、COBE袋をロードする緑のチューブを除くすべてのチューブをクランプし、0に外1500速度を設定し、スーパー。
  2. フード内でポンプと勾配のビーカーを設置し、緑のチューブにコレクションチューブを接続する。
  3. 今フィコール1.100のロードが開始することができます:"スピン"プッシュは、フロントビーカーにフィコール1.100の110 mlを追加し、COBE袋をロードするためにポンプを起動します。フィコールがロードされると、、スーパーを押してポンプを停止し、ポンプヘッドをアンクランプし、100超アウト速度を設定します。
  4. フィコールをビーカーに達すると、すべての空気がポンプヘッドにチューブ、再クランプから追放されている場合。 3,000〜スピン速度、および超アウト速度を0に設定します。
  5. 今はフロントビーカーに重い勾配を注いでグラデーションをロードするための準備。少しの空気を除去する2つのビーカーの間にクランプを解除してください。その後戻ってビーカーの中に光のグラデーションを注ぐ。
  6. マグネチックスターラーの電源を入れ、、COBEのマシン上で"スピン"を押して2つのビーカーを接続するチューブからクランプを削除し、視覚的に重いと光のグラデーションが混合されていることを確認します。
  7. 勾配は、混合開始後は、遠心機の電源を入れます。 1分間待ってから、混合勾配をロードするためにポンプの電源を入れます。
  8. 組織は、ローディングチューブを入力して空気を可能にするのに十分低い勾配は、フロントビーカーに低い実行させ、ではなく、ロードするには、その後ビーカーを接続するチューブをreclampと組織をロードする。
  9. 組織の残りの部分を追加していきます。その後、洗浄溶液の50mlで組織を保持していたチューブを洗浄し、フロントビーカーを洗浄するためにそれを使用。
  10. 組織の最後は袋に入ると、同時に、ポンプを停止し、ポンプヘッドでアンクランプ、および袋上記のチューブをクランプする。 5分間遠心し続けます。
  11. 遠心分離を継続しながら、ボンネットに12のコレクションチューブを持参し、そのキャップを緩めます。黄色のチューブにコレクションチューブを取り付け、コニカルチューブ1内に滅菌したコレクションの先端を配置。その後、黄色のチューブをアンクランプし、緑のチューブをクランプする。
  12. スピンが終了すると、徐々に100にSuperoutを上げる。チューブ1の150mlを収集する。その後、チューブ2-12(200〜230ミリリットルから)に30 mlを収集する。
  13. 収集が完了すると、COBEの"STOP"を押してください。今精製が終了したことを、小島が評価され、培養することができる。

2。サンプリングと文化

  1. 精製された島の分画を収集した後、12のコレクションチューブの各々からサンプルを削除し、ジチゾンで染色。染色は、層の低純度の小島で高純度の小島対層が含まれているであるかが表示されます。
  2. 一緒にそれぞれ高及び低純度の組織とプールを収集する。
  3. スピンと2回洗浄する。回目の洗浄後、最後の洗浄のメディアで250mlにそれぞれのボリュームをもたらす。
  4. 評価するためにプールされたフラクションは低いからプールされた画分と1つの1 mlの試料の高さから2つの1 mlのサンプルを取ることから始めます。洗浄溶液9 mlを入れたコニカルチューブに各1ミリリットルサンプルを転送します。
  5. その後、各15 mlチューブから数えて皿に​​1 mlを入れる。顕微鏡下で細胞を調べて、カウント。
  6. (小数における島の総EIN /純度)/(フラスコあたり30,000 EIN):細胞をカウントした後に文化、以下の式を使用して、小島をするために必要なフラスコ数を計算する。例えば、90%の純度を持つ100,000小島は、4フラスコで培養されています。
  7. 37˚C、5%CO 2インキュベーター内でT175フラスコと文化に島を転送する。

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Discussion

人間の膵島分離の技術において著しい進歩にもかかわらず、膵島の収量は非常に変化し、予測不能のまま。消化された膵組織の精製は、移植のための成功した酵素消化後に十分な島の質量を回復することが重要です。高純度ヒト膵島の優れた回復がこのメソッドを使用して実証されたためUIC精製法が推奨されます。また、消化された組織の最大50 mlをこのように分離に使用される合計時間を短縮することによってヒト膵島の虚血に関連する負傷を最小限に抑える、精製のために実行する単一のCOBEにロードすることができます。

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Acknowledgements

イリノイ大学シカゴ校から設立だけでなく、膵島細胞リソースセンターNIHの助成金(RFA - RR 05から003)、クリストファー財団、Efroymson財団、およびテラブス財団によってサポート。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
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  5. Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
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  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
  9. Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).

Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

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