Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Biology

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Summary

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

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Abstract

Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos

Protocol

1. Purificação de ilhotas

  1. Para iniciar o processo de purificação de ilhotas, carregar o saco de COBE, braçadeira todos os tubos exceto o tubo verde, e defina a velocidade para 1.500 e os super fora a 0.
  2. Na capa configurar os copos bomba e gradiente e conectar o tubo de coleta para o tubo verde.
  3. Agora o carregamento do Ficoll 1,100 pode começar: push "spin" em seguida, adicione 110 ml de Ficoll 1,100 para o copo da frente, e começar a bomba, a fim de carregar o saco de COBE. Como o Ficoll é carregado, pressione super-out, parar a bomba, unclamp a cabeça da bomba e definir a velocidade com super 100.
  4. Quando o Ficoll atinge o copo e todo o ar é expulso da tubulação, re-braçadeira na cabeça da bomba. Definir a velocidade de rotação de 3.000, ea velocidade com super 0.
  5. Agora prepare-se para carregar os gradientes vertendo o gradiente pesado no copo da frente. Ligeiramente liberar o grampo entre os dois copos para remover qualquer ar. Em seguida, despeje o gradiente de luz para o copo de volta.
  6. Ligar o agitador magnético, pressione "spin" na máquina COBE, remova o grampo do tubo que conecta os dois copos, e verifique visualmente se os gradientes pesados ​​e leves são a mistura.
  7. Uma vez iniciados os gradientes de mistura, ligar a centrífuga. Espere um minuto, e depois ligar a bomba para carregar os gradientes de mistura.
  8. Para carregar o tecido deixa o gradiente escassear no copo da frente, mas não baixa o suficiente para permitir que o ar a entrar no tubo de carga, então reclamp o tubo que liga os copos e carregar o tecido.
  9. Continue adicionando o resto do tecido. Em seguida, lave o tubo que mantinha o tecido com 50 ml de solução de lavagem, e usá-lo para lavar o copo da frente.
  10. Como o último do tecido entra no saco, simultaneamente parar a bomba, unclamp na cabeça da bomba e pinça tubagens acima do saco. Continuar a centrifugar por 5 minutos.
  11. Enquanto continua a centrifugação, trazer os 12 tubos de coleta para a capa e afrouxe suas tampas. Conecte o tubo de coleta para o tubo amarelo, e colocar a ponta de coleta estéril em um tubo cônico. Então unclamp o tubo amarelo, e prender o tubo verde.
  12. Quando termina a rodada, levante lentamente Superout a 100. Coletar em tubo de 150 ml 1. Em seguida, coletamos 30 ml em tubos de 2-12 (200-230 ml).
  13. Uma vez que coleção é completa, pressione "STOP" no COBE. Agora que terminou de purificação, as ilhotas podem ser avaliados e cultura.

2. Amostragem e cultura

  1. Depois de coletar as frações purificadas ilhotas, retirar uma amostra de cada um dos 12 tubos de coleta e mancha com Ditizona. A coloração vai mostrar quais são as camadas contêm ilhotas de alta pureza versus camadas com ilhotas de baixa pureza.
  2. Recolher as tecido de alta pureza e baixa e piscina de cada conjunto.
  3. Spin e lavar duas vezes. Depois da segunda lavagem, reduzir o volume de cada um para 250 ml com a mídia Wash Final.
  4. Para avaliar a frações pooled começar por tomar duas amostras de 1 ml do alto das frações agrupadas e uma amostra de 1 ml da baixa. Transferência de cada amostra de 1 ml para um tubo cônico contendo 9 ml de solução de lavagem.
  5. Em seguida, transferir 1 ml de cada tubo de 15 ml a um prato de contagem. Examinar e contar as células ao microscópio.
  6. Após a contagem das células calcular o número de frascos necessários à cultura das ilhotas usando a seguinte fórmula: (EIN total / pureza de ilhotas em decimal) / (30.000 EIN por frasco). Por exemplo, 100 mil ilhotas com pureza de 90% são cultivadas em 4 frascos.
  7. Transferir os ilhéus para T175 frascos e cultura num 37 ˚ C e 5% CO 2 incubadora.

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Discussion

Apesar de avanços significativos nas técnicas de isolamento de ilhotas humanas, o rendimento de ilhotas permanecem altamente variável e imprevisível. Purificação do tecido pancreático digeriu é crucial para recuperar uma massa isle suficiente após digestão enzimática de sucesso para transplante. O método de purificação UIC é recomendado porque uma recuperação superior de alta pureza ilhotas humanas foi demonstrada usando este método. Além disso, até 50 ml de tecido digerido pode ser carregado em uma única Cobe correr para a purificação, minimizando assim a isquemia associada lesão das ilhotas humanas, encurtando o tempo total utilizado no isolamento.

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Acknowledgements

Suportado pela fundação da Universidade de Illinois em Chicago, bem como celular Islet Resource Center NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
  9. Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).

Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

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