Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

Published 7/13/2009
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Summary

In diesem Video zeigen wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert

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Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model. J. Vis. Exp. (29), e1366, doi:10.3791/1366 (2009).

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Abstract

Die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) wurde entwickelt,

Protocol

I. Tissue Klimaanlage - Tag 0

  1. Nach Erhalt der EpiDerm EPI-200-SIT-Kit, überprüfen Sie alle Komponenten des Kits für Integrität (für Kit Details siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte).
  2. Für alle drei EpiDerm Gewebe, bereiten ein steriles 6-well-Platte mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt.
  3. Unter sterilen Bedingungen, öffnen Sie den Plastikbeutel mit dem 24-Well-Platte mit den EpiDerm Gewebe und entfernen Sie die sterile Gaze.
  4. Verwenden einer sterilen Pinzette zu jeder Einsatz mit den EpiDerm Gewebe zu entfernen und den Einsatz in den leeren 24-Well-Platte. In diesem Schritt entfernen Sie alle verbleibenden Versand Agarose, dass an den Außenseiten des Einsatzes haftet durch sanfte Blotting auf sterilem Filterpapier.
  5. Innerhalb der nächsten 5 Minuten, visuell den Geweben. Verwenden Sie keine defekten Gewebe oder Gewebe, die vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind.
  6. Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen sorgfältig trocknen die Oberfläche des Gewebes. Versuchen Sie nicht, das Gewebe direkt berühren - Kapillare Effekte sind ausreichend, um die Feuchtigkeit aus dem Gewebe Oberfläche zu entfernen.
  7. Nach dem Trocknen der Gewebeoberfläche, Transfer drei Gewebe der oberen Reihe der 6-well-Platten mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. Veröffentlichung Luftblasen unter der Einsätze gefangen.
  8. Legen Sie die 6-well-Platten, die die Einsätze in den Inkubator für 60 ± 5 min Vorinkubation bei 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH (relative Luftfeuchtigkeit).
  9. Am Ende der 60 ± 5 min Vorinkubation Zeitraum speichern, übertragen die Einsätze aus dem oberen Brunnen in den unteren Vertiefungen der 6-Well-Platte. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für eine Übernachtung Vorinkubation (18 ± 3 h).
  10. Platzieren Sie den Rest der Assay-Medium in den Kühlschrank (5 ± 3 ° C). Nach der Übernachtung Vorinkubation, kann der Test Chemikalien für die EpiDerm Gewebe aufgetragen werden.

    Hinweis: Die Vorinkubation Verfahren kann im Falle einer verspäteten Lieferung Gewebe verkürzt werden (zB wenn Gewebe am Mittwoch anreisen, statt Dienstag).

II. Chemische Beanspruchung - Tag 1

  1. Bereiten Sie ein 6-Well-Platte je Testchemikalie, indem die obere Reihe nur mit 0,9 ml pro Vertiefung der Assay-Medium.
  2. Etwa 5 Minuten vor der geplanten Exposition gegenüber chemischen Stoffen, entfernen Sie die 6-well Platten mit den vorkonditioniert Gewebe aus dem Inkubator.
  3. Beurteilen Sie die Oberfläche von Geweben und entfernen Sie alle Feuchtigkeit mit sterilem Baumwolle Tipps.
  4. Kennzeichnen Sie alle 6-Well-Platte Deckel mit dem Testmaterial Codes oder Namen.
  5. Dosieren Sie das Gewebe mit dem Test-Chemikalien in Intervallen von 1 Minute zu erleichtern Spülen der Testsubstanzen nach der Exposition. Halten Sie die Platten mit dosierten Gewebe in die sterile Haube, bis der letzte Gewebe dosiert wird.
  6. Um zu testen, flüssige Chemikalien, verzichten 30 ul der Lösung direkt oben auf das Gewebe und setzen Sie die Nylon-Mesh-Gewebe auf der Oberfläche. Wenn nötig, vorsichtig Position des Netzes mit der Glühbirne geleitet Glas Pasteur Pipette. Drücken Sie nicht auf der Gewebeoberfläche.
  7. Für die Prüfung semisolids, verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette auf 30 ul direkt oben auf das Gewebe zu verzichten. Bei Bedarf verteilt die Chemikalie mit Pasteurpipette zur Deckung der Gewebeoberfläche so viel wie möglich.
  8. Für feste Materialien, kurz vor der Applikation der Testsubstanz, befeuchten Sie die Gewebeoberfläche mit 25 &mgr; l sterilem DPBS. Dies verbessert die Berührung der Gewebeoberfläche mit der Testchemikalie. Füllen Sie eine 25 mg kalibriert scharfe Anwendung Löffel (oder einem anderen geeigneten Werkzeug) mit ca. 25 mg fein gemahlenes Probenmaterial. Übernehmen Sie die feste Testchemikalie auf der Gewebeoberfläche. Falls erforderlich, eine Glühbirne geleitet Pasteur Pipette, um den Löffel komplett leer. Schütteln Sie die Einsätze, um die Ausbreitung der Feststoff auf der Oberfläche zu verbessern.
  9. Für Testsubstanzen mit wachsartiger Konsistenz, versuchen Sie, eine flache "Cookie wie" Stück ca. 8 mm Durchmesser in Form und legen Sie es oben auf das Gewebe, die zuvor mit sterilem DPBS benetzt. Zur Verbesserung des Kontaktes zwischen Prüfsubstanz und Gewebe, wiegen Sie die "Cookie" mit einer Edelstahl oder Kunststoff zu helfen.
  10. Bewerben DPBS als negative Kontrolle und 5% SDS als positive Kontrolle, die Kontrolle Gewebe.
  11. Nach der Dosierung der letzten Gewebe, übertragen alle Platten für 35 ± 1 Minuten, um die befeuchteten Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH).
  12. Nach dem 35 ± 1 Minuten Inkubation bei 37 ° C entfernen Sie alle Platten aus dem Inkubator. Legen Sie die Platten in die sterile Haube und warten, bis ein Zeitraum von 60 Minuten Exposition gegenüber chemischen Stoffen zum ersten dosiert Gewebe abgeschlossen ist.
  13. Anschließend starten Sie den Waschvorgang mit der ein Einsatz pro Minute Zeitintervall (zum Versichee, dass die gesamte Belichtungszeit für jeden Einsatz 60 Minuten).
  14. Verwenden Sie eine Waschflasche, um das Gewebe mit einer sterilen DPBS spülen. Füllen Sie das Gewebe einfügen 15 Mal mit einem konstanten Strom von DPBS und leeren Sie ihn. (Hinweis: für Gewebe mit einer Nylon-Mesh, waschen Sie die Gewebeoberfläche 5 Mal und entfernen Sie das Netz vorsichtig mit der spitzen, scharfen Zangen Danach die restlichen weiter 10 Wäschen).
  15. Nach dem 15. Spülen mit der Waschflasche, komplett versenken den Einsatz 3-mal in 150 ml DPBS und schütteln, um den Rest des Tests Material zu entfernen.
  16. Schließlich spülen die Gewebe einfügen einmal von innen und einmal von außen mit einer sterilen DPBS.
  17. Entfernen Sie überschüssiges von DPBS aus dem Gewebe durch leichtes Schütteln des Einsatzes und Blotting auf die sterile Löschpapier.
  18. Übertragen Sie die ausgelöscht Gewebe fügt dem neuen 6-Well-Platte zuvor mit Assay-Medium vorgefüllt. Alle diese Schritte (14-18) muss innerhalb von 1 min für jeden Einsatz durchgeführt werden.
  19. Nach dem letzten Gewebe gespült, sorgfältig trocknen die Oberfläche jedes Gewebe mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen.
  20. Inkubieren des Gewebes in den Inkubator für die nächsten 24 ± 2 Stunden (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH).

    Hinweis: Jeder Test Techniker sollte nicht testen mehr als 6 Testsubstanzen einschließlich der negativen und positiven Kontrollen in einem einzigen Testlauf (set), in der Lage sein zu folgen das Protokoll, wie unten beschrieben

III. Medium Austausch - Tag 2

  1. Nach dem 24 ± 2 Stunden nach der Inkubation, übertragen Sie die Einsätze in den unteren Teil der 6-Well-Platte mit 0,9 ml Medium vorgefüllt. Medien aus dem oberen Zeilen können für die Analyse der zusätzlichen Endpunkten (Zytokine, Chemokine etc.) gesammelt werden. Die Analyse der sekundären Endpunkte ist optional.
  2. Fahren Sie mit dem Post-Inkubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für weitere 18 ± 3 Stunden.

IV. MTT Viability Assay - Tag 3

  1. Label zwei 24-Well-Platten mit dem chemischen Namen oder Codes. Eine Platte wird für die Gewebe-Inkubation mit MTT dienen und die andere für die Extraktion.
  2. Bereiten Sie die MTT-Lösung durch Auftauen des MTT-Konzentrat (5 mg / ml) und Verdünnung mit dem MTT Verdünnungsmittel. Endkonzentration von MTT-Lösung ist 1 mg / ml.
  3. Pipette 300 ul MTT-Lösung in jedes Well der 24 Well-Platte.
  4. Entfernen Sie die 6-well Platten aus Inkubator, trocknen Sie die Unterseite der Einlagen auf einem Löschpapier, und übertragen sie in die 24-Well-Platte vorgefüllt mit MTT.
  5. Platzieren Sie den 24-Well-Platte in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) und Inkubation für 3 Stunden ± 5 min. Strikt an die 3 Stunden halten ± 5 min Inkubationszeit auf Abweichung zwischen verschiedenen MTT Lesungen zu vermeiden.
  6. Wenn die MTT Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Saugpumpe vorsichtig absaugen MTT-Medium in allen Bohrungen.
  7. Füllen Sie den Brunnen mit DPBS und wieder absaugen. Dieser Spülvorgang noch zweimal und stellen Sie sicher, dass die Gewebe trocken sind nach der letzten Aspiration.
  8. Nach dem Waschen Transfer der Einsätze, um eine neue 24-Well-Platte. Tauchen Sie die Einsätze durch vorsichtiges Pipettieren 2 mL Extraktionsmittel-Lösung (Isopropanol) in jedes einzufügen. Der Pegel wird über den oberen Kanten des Einsatzes steigen, damit Notlaufeigenschaften Gewebe.
  9. Seal der 24-Well-Platte (zB mit Parafilm oder mit Dichtkissen) zu Extraktionsmittel Verdunstung zu hemmen. Entpacken Sie die MTT aus dem Gewebe, das für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler (ca. 120 rpm). Übernachtung Extraktion ohne Schütteln kann auch verwendet werden.
  10. Nach der Extraktion Zeitraum abgeschlossen ist, dringen die Einsätze mit einer Injektionsnadel oder Birne Perlen Pasteurpipette und lassen Sie den Auszug in die Brunnen, aus dem das Insert getroffen wird.
  11. Entsorgen Sie die punktierten einfügen und Pipette die Lösung in der auch oben und unten drei Mal, bis sie homogen ist.
  12. Für jedes Gewebe, übertragen zwei 200 ul Aliquots der violetten Formazan-Lösung in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie die Duplikate nach der festen Platte Design in der Tabelle zu dieser Video-Protokoll gegeben. Für Rohlinge verwenden Isopropanol.
  13. Lesen Sie die optische Dichte (OD) des MTT-Extrakte in einem 96-Well-Platte Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 570 nm (540-580), ohne eine Referenz zu filtern.
  14. Geben Sie die Ergebnisse in die Tabelle für die automatische Berechnung der Ergebnisse (Abb. 1).
  15. Ein Testchemikalie "reizend" (R38 oder GHS Kategorie 2) gekennzeichnet werden, wenn die prozentuale Lebensfähigkeit des Gewebes durch MTT-Assay bestimmt ist <50% bezogen auf das negative Kontrolle.

    Hinweis: MTT ist giftig, so achten Sie darauf, Schutzhandschuhe zu tragen beim Umgang. Schützen MTT und seine sosungen aus Licht, da MTT ist lichtempfindlich. Verwenden MTT-Lösung innerhalb weniger Stunden nach der Zubereitung, weil es im Laufe der Zeit verschlechtert.

V. Assay Qualitätskontrollen

  • EpiDerm EPI-200-SIT-Kit Annahmebedingungen:

    In-vitro-RHE-Modellen sollten einheitliche, qualitativ hochwertige Daten über die Zeit geben, nicht nur bei der Validierung (8). Empfohlene Richtlinien zur langfristigen Assay-Reproduzierbarkeit und Leistung zu gewährleisten sind "vollständige Charakterisierung von Zellen oder Geweben, Probenahme jeder Partie ... für Leistung und regelmäßigen Gebrauch von Kontrollen und Benchmark Chemikalien, um Gewissheit über die Konsistenz der Assay-Leistung bieten" (9) . Neben Assay Akzeptanzkriterien unten dargelegt, ist jede Produktion viel EpiDerm Qualitätskontrolle durch den Hersteller gegen eine zusätzliche Benchmark chemische getestet (1% Triton X-100). Die Belichtungszeit benötigt, um Gewebeviabilität zu 50% (ET-50) für Triton X-100 ist bestimmt zu reduzieren. Für EpiDerm haben Jahresdurchschnitt ET-50-Werte von 5,9 Stunden auf 7,5 Stunden lag. Die Charge zu Charge CV für negative Kontrolle Gewebe (dh die Variabilität in Baseline Lebensfähigkeit) hat unter 7,5% für jedes Jahr seit 1996 gemittelt. Um die ET50 Wert jeder Produktionscharge müssen innerhalb von 2 Standardabweichungen von dem historischen Durchschnitt Triton X-100 ET50 in 1996 (;; geringere Akzeptanz limit = 4.8h oberen Akzeptanz limit = 8.7h dh ET-50 = 6,7 Stunden) gegründet fallen für die Verwendung durch den Hersteller freigegeben werden.

  • EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 1: Negative Kontrolle:

    Die absolute OD der negativen Kontrolle (NC) Gewebe (Behandlung mit sterilen DPBS) im MTT-Test ist ein Indikator für die Lebensfähigkeit des Gewebes im Prüflabor nach Transport und die Lagerung Verfahren und unter bestimmten Bedingungen für die Verwendung erhalten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere OD 570 von der NC Gewebe ist ≥ 1,0 und ≤ 2,5.

  • EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 2: Positive Control

    A 5% SDS (in H 2 O)-Lösung wird als positive Kontrolle (PC) verwendet werden und gleichzeitig mit dem getesteten Chemikalien getestet. Concurrent bedeutet, dass der PC in jedem Assay getestet werden, aber nicht mehr als ein PC pro Testtag erforderlich ist. Die Lebensfähigkeit der positiven Kontrolle sollte innerhalb von 95% Konfidenzintervall der historischen Daten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere Lebensfähigkeit der PC Geweben exprimiert in% der negativen Kontrolle Gewebe beträgt 20%.

  • EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 3: Standardabweichung (SD)

    Die Hautreizung wird aus der mittleren Tragfähigkeit auf 3 Einzel-Geweben bestimmt vorhergesagt und somit die Variabilität der Gewebe repliziert werden sollte akzeptabel niedrig. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die SD von einzelnen% Gewebe Bewohnbarkeit der 3 gleich behandelt berechnet repliziert ist <18%.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1
Abbildung 2
Abbildung 3
Abbildung 1 Ergebnisse für 6 Test Artikel, NC und PC-Steuerung erhalten -. Ein Teil der automatisierten Tabellenkalkulation für die Berechnung der Ergebnisse. Testen Sie Chemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes unter 50% bezogen auf NC reduziert werden als reizend eingestuft. Der Test ist optimiert, um Ergebnisse, die weit genug von der Einstufung cut-off (50% Rentabilität) erhöht so die Stabilität des Assays bieten.

Materialien
Material-Liste

Discussion

In diesem Video haben wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert für die in vitro Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe nachgewiesen. Bei der Durchführung dieser Methode ist es wichtig, in aseptischen Bedingungen zu arbeiten und sich streng an den validierten Protokoll, da Abweichung vom Protokoll unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Einige Modifikationen des Tests sind möglich, jedoch sollten Änderungen an dem Protokoll direkt mit den Autoren diskutiert werden.

Die einzige Einschränkung dieser Methode ist, eine mögliche Störung der Testsubstanz mit dem MTT-Endpunkt. Eine farbige Prüfsubstanz oder eine, die direkt reduziert MTT (und damit imitiert Dehydrogenase-Aktivität der Mitochondrien) können mit dem MTT Endpunkt stören. Allerdings sind diese Testsubstanz nur ein Problem, wenn zum Zeitpunkt des MTT-Test (dh 42 Stunden nach der Testsubstanz Exposition) ausreichende Mengen der Testsubstanz sind immer noch auf den heutigen (oder in) der Gewebe. Bei dieser unwahrscheinlichen Fall, die (wahre) metabolische MTT-Reduktion und der Beitrag durch eine farbige Testmaterial oder (false) direkten MTT-Reduktion durch das Testmaterial kann durch ein Verfahren im Detail in dem Test Standard Operation Procedure bereitgestellt durch beschrieben quantifiziert werden MatTek Corp

Acknowledgements

Die Autoren danken an der BfR (Deutschland), BASF SE (Deutschland), IIVS Inc. (USA), zet-LSL (Österreich) ZEBET für die Teilnahme an Multi-center internationalen Validierungsstudie der Modified EpiDerm SIT (5 ).

References

  1. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
  2. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
  3. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. Forthcoming (2009).
  4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
  5. Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, (2008).
  6. United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
  7. ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. ESAC. (2008).
  8. Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
  9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).

Comments

2 Comments

  1. What is the price for SIT kit?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2011 - 3:15 PM
  2. Please direct your inquiry to bknapp@mattek.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2011 - 4:03 PM

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