Поколение прав CD40 активированных В-клеток

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

В этом видео мы представляем

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

CD40 активированных В-клеток (CD40-лимфоцитов) были определены в качестве альтернативного источника иммуно-стимулирующего антиген-представляющих клеток (АПК) для иммунотерапии рака 1-3. По сравнению с дендритные клетки (ДК), лучше всего характеризует APC, CD40-лимфоцитов иметь несколько различных биологических и технических свойств. Как и в DC, В-клетки показывают повышенную экспрессию МНС и костимулирующих молекул (рис.1б), проявляют сильный миграционный потенциал и настоящее презентации антигена эффективно Т-клетки, после стимуляции интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L). Однако, в отличие от незрелых или зрелых ДК, CD40-B клетки экспрессируют полный лимфатических узлов самонаведения триаду, состоящую из CD62L, CCR7/CXCR4 и лейкоцитов функции антиген-1 (LFA1, CD11a/CD18), необходимых для наведения на вторичных лимфоидных органах (рис. 1а) 3. CD40-B клетки могут быть получены без трудностей от очень небольших количествах периферической крови, которая может быть расширена в пробирке до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10 9 клеток на одного пациента) от здоровых доноров, а также рака пациентов (Fig.1c, г) 1,4.

В этом протоколе мы покажем, как получить полностью активирована CD40-В-клетки из человеческой РВМС. Основные молекулы, для культуры клеток являются CD40 лиганд, интерлейкин-4 (ИЛ-4) и циклоспорин (CSA), которые пополняются в 3-4 цикла культура день. Для лабораторных целей CD40 стимуляции обеспечивается NIH/3T3 клеток, экспрессирующих рекомбинантный человеческий CD40 лиганд (tCD40L NIH/3T3) 5. Во избежание загрязнения с неправительственными организациями, трансфицированных клеток, экспрессию человеческого CD40 лиганда на трансфектантов должен регулярно проверяться (рис.2).

После 14 дней CD40-B культурах клеток состоят из более чем 95% чистой клеток и расширение CD40-B клеток в течение 65 дней часто удается без потери функции 1, 4. CD40-В-клеток эффективно заниматься, обработки и представления антигенов Т-клеток 6. Они не только простые naϊve, но и расширяют ячеек памяти T 7,8. CD40 активированных В-клеток может быть использована для изучения В-клеточной активации, дифференцировки и функции. Более того, они представляют собой перспективный инструмент для использования в терапевтических или профилактических прививок против опухолей 9.

Protocol

Протокол для поколения человеческие CD40 активированных В-клеток РВМС делится на две части: часть демонстрирует подготовку CD40 лиганд выражения NIH/3T3 клетки, которые будут использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерные клетки. Часть В описывает фактические CD40-B культуры.

А. Подготовка фидерных клеток (tCD40L NIH/3T3)

TCD40L NIH/3T3 является сторонником мышиной линии клеток фибробластов, которые никогда не должны стать полностью вырожденная. Клетки, таким образом, разделил два раза в неделю. Культивирование в течение более 6 недель не рекомендуется.

  1. Удалить старые среды от первичной культуры с стерильной пипетки и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте PBS после мытья.
  2. Добавить 4 мл трипсина / ЭДТА в 75 см 2 колбы в течение 5-10 минут при температуре 37 ° C. Используйте нежное нажмите, чтобы отделить клетки.
  3. Добавьте 10 мл дикий тип среды и поворота мягко.
  4. Передача клеточной суспензии в 50 мл трубки с стерильной пипетки и спина ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 мин.
  5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл дикий тип среды. Граф количества клеток аликвоту суспензии клеток и подготовить три 50 мл трубки с соответствующим количеством клеток:
    1. 1,5 х 10 6 клеток для субкультивирования
    2. 0,2 х 10 6 клеток / лунку для облучения используется для CD40-B культуре клеток
    3. Остальная заморозить (при необходимости).
  6. Спиновые ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 мин.
  7. Удалить супернатант.
    1. Для субкультивирования: ресуспендирования 1,5 х 10 6 клеток в 10 мл дикий тип среды в 75 см 2 колбы культуры клеток (плотность клеток 1,5 х 10 5 клеток / мл), добавить G-418 [0,7 мг / мл] и инкубировать клеток 37 ° C с 5% CO 2. Сплит клетки два раза в неделю.
    2. Для CD40-B культуре клеток: Вам нужно 1,2 х 10 6 клеток на один 6-луночный планшет. Ресуспендируют клеток в дикой среде типа с плотностью 0,1 х 10 6 клеток / мл и облучать их на 78 Гр. Пластина 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать их при температуре 37 ° C с 5% CO 2. Используйте этот подготовленные пластины для В-клеток при стимуляции tCD40L NIH/3T3 клетки приверженцем (по крайней мере 4 часа: проверять соблюдение с микроскопа, не ждать более 24 ч до начала В-клеточной стимуляции). (Продолжить с Б.)

Б. CD, 40-Б культуре клеток

I. Подготовка МНПК для стимуляции CD40 (день 0):

Обратите внимание: перед тем как продолжить констатировать, что фидерных клеток являются приверженцем. Всегда добавляйте свежие решения интерлейкина-4 и циклоспорина в питательную среду непосредственно перед употреблением.

  1. Возьмите МНПК, либо свежие или надлежащим образом талой. Ресуспендируют МНПК дважды в 50 мл 1 раз PBS, чтобы вымыть их и со спином вниз впервые на 265 мкг в течение 7 минут, а второй раз при 190 мкг в течение 7 минут, чтобы удалить другие клетки. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 20 мл PBS. Определить номер ячейки в аликвоту клеточной суспензии.
  2. Спином вниз необходимое количество клеток в 225 мкг в течение 5 мин. Для 6-луночный планшет 4 х 10 6 клеток / лунку необходимо, таким образом, 24 х 10 6 клеток на чашку.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируйте РВМС на 1 х 10 6 клеток / мл в CD40-B культуральной среде недавно дополнена с 50 ЕД / мл интерлейкина-4 в качестве фактора роста и 0,63 мкг / мл циклоспорин для предотвращения результатом Т-клеток (С учетом концентрации относятся к одной среды культуры мл!).
  4. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с tCD40L NIH/3T3 клеток.
  5. Вымойте приверженцем tCD40L NIH/3T3 клеток с 2 мл PBS на лунку первом и во втором шаге 2 мл CD40-B средний стирки.
  6. Аккуратно добавить 4 мл РВМС подвески (1 х 10 6 клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
  7. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO 2.
  8. На 7-й день, reculture клеток (Продолжить 3.2.).

II. Рекультивация CD40-лимфоцитов (7-й день, а затем каждые 3-4 дня):

  1. Урожай кластеров CD40-лимфоцитов из 6-луночный планшет по ресуспендированием с 10 мл пипетки и бассейном их в 50 мл трубки.
  2. Спином вниз на 225 мкг в течение 7 минут и полностью заменяют собой супернатант с CD40-B средний стирки. При подсчете количества ячейки аликвоту, спина ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 минут. Ресуспендируют CD40-клеток в CD40-B культуральной среде при концентрации 1 х 10 6 клеток / мл.
  3. Добавить свежие решения интерлейкина-4 в концентрации 50 ЕД / мл и 0,63 мкг / мл циклоспорин в среду.
  4. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с tCD40L NIH/3T3 клеток.
  5. Вымойте прилипшие клетки с 2 мл PBS на лунку первом и во втором шаге 2 мл CD40-B средний стирки.
  6. 6 клеток / мл) CD40-B подвески в каждую лунку 6-луночный планшет.
  7. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO 2.
  8. Субкультура клетки снова каждые 3-4 дней, чтобы закончить с высокой чистоты человеческого CD40 активированных В-клеток после общей сложности 14 дней.

C. Устранение неисправностей - Что делать, если CD40-B клетки не растут?

  1. Проверяли ли Вы для CD40 лиганд выражение фидерных клеток?
  2. Пластинчатых связаны фидерные клетки используются для стимуляции не должны быть старше 24 часа?
  3. Является ли загрязнение микоплазмой возможно?
  4. Был интерлейкина-4 раствор, используемый для добавки свежей талой и имел соответствующее биологической активности?
  5. Был циклоспорина добавили в правильной концентрации?

Рисунок 1
Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения фигуры 1.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics