Author Produced

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذا الفيديو نقدم

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد تم تحديد CD40 تنشيط خلايا B (CD40 - B الخلايا) كمصدر بديل للالمناعية تنشيطية مستضد تقديم الخلايا ، 1-3 (APC) لعلاج مناعي السرطان. بالمقارنة مع الخلايا الجذعية (DCS) ، وأفضل APC تتسم ، CD40 - B وخلايا عدة متميزة الخصائص البيولوجية والتقنية. مماثلة للبلدان النامية ، تظهر الخلايا B تعبير زيادة MHC وشارك في تنشيطية جزيئات (Fig.1b) ، المعرض قدرة قوية المهاجرة وتقديم العرض مستضد بكفاءة إلى خلايا T ، بعد التحفيز مع يجند انترلوكين 4 و CD40 (CD40L). لكن ، على النقيض من البلدان النامية غير ناضجة أو ناضجة ، CD40 - B الخلايا التعبير عن العقدة الليمفاوية ثالوث صاروخ موجه كامل يتكون من CD62L ، CCR7/CXCR4 وظيفة الكريات البيض مستضد - 1 (LFA1 ، CD11a/CD18) ، اللازمة لصاروخ موجه إلى الأجهزة اللمفاوية الثانوية (Fig.1a) 3. يمكن أن تتولد CD40 - B الخلايا دون صعوبات من كميات صغيرة جدا من الدم المحيطي التي يمكن مزيد من التوسع في المختبر لكميات كبيرة جدا من درجة عالية من محض CD40 - B الخلايا السرطانية (> 10 9 خلايا لكل مريض) من المتبرعين الأصحاء وكذلك مرضى (Fig.1c ، د) 1،4.

في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية الحصول على تفعيلها بشكل كامل CD40 - B الخلايا من PBMC الإنسان. الجزيئات الأساسية للثقافة الخلية هي CD40 يجند ، انترلوكين 4 (IL - 4) ، والسيكلوسبورين A (CSA) ، والتي تتجدد في حلقة اليوم ثقافة 3-4 لأغراض المختبر قدمت CD40 - تحفيز الخلايا التي NIH/3T3 معربا عن المؤتلف الإنسان CD40 يجند (tCD40L NIH/3T3) 5. لتجنب التلوث مع المنظمات غير transfected الخلايا ، والتعبير ليجند CD40 الإنسان على transfectants يجب أن يكون محددا بشكل منتظم (Fig.2).

بعد 14 يوما CD40 B - الثقافات الخلية تتكون من خلايا أكثر من 95 ٪ ب نقية وتوسيع CD40 - B الخلايا أكثر من 65 يوما هو ممكن في كثير من الأحيان من دون أي خسارة وظيفة 1 و 4. CD40 - B الخلايا تأخذ بكفاءة أعلى ، و 6 مولدات المضادات العملية الحالية لخلايا تي. انهم لا naϊve فقط الوزراء ، وإنما أيضا توسيع الخلايا التائية الذاكرة 7،8. ويمكن استخدام CD40 تنشيط خلايا B لدراسة الخلية B - التنشيط ، والتمايز وظيفة. وعلاوة على ذلك ، لأنها تمثل أداة واعدة للقاح علاجي أو وقائي ضد الأورام 9.

Protocol

وينقسم البروتوكول لتوليد خلايا B التي تنشط من CD40 PBMC إلى جزأين : الجزء A يدل على إعداد CD40 يجند NIH/3T3 معربا عن الخلايا ، والتي سوف تستخدم في الخلايا المغذية لوحة محدد. الجزء باء يصف الفعلية CD40 - B الثقافة.

A. إعداد الخلايا المغذية (tCD40L NIH/3T3)

وNIH/3T3 tCD40L هو ملتصق الخلية الليفية خط الفئران ، والتي لا ينبغي أبدا أن تصبح متكدسة تماما. وبالتالي فإن الخلايا splitted مرتين في الأسبوع. لا ينصح زراعة على مدى أكثر من 6 أسابيع.

  1. إزالة المتوسطة القديمة من ثقافة الأولية مع ماصة معقمة وغسل الخلايا مع 10 مل من 1X PBS. نضح في برنامج تلفزيوني بعد الغسيل.
  2. إضافة 4 مل التربسين / EDTA في قارورة 75 2 سم لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية. استخدام التنصت لطيف لفصل الخلايا.
  3. إضافة 10 مل من النوع المتوسط ​​البرية ودوار بلطف.
  4. نقل تعليق الخلية في أنبوب 50 مل مع ماصة معقمة وتدور في الخلايا أسفل نحو 225 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة وطاف resuspend الكرية في 10 مل من النوع المتوسط ​​البرية. حساب عدد الخلايا من قسامة لتعليق الخلية وإعداد ثلاث أنابيب 50 مل مع عدد مناسب من الخلايا :
    1. 1.5 × 10 6 خلايا لsubculturing
    2. 0.2 × 10 6 خلية / جيد لتشعيع المستخدمة لزراعة الخلايا CD40 - B
    3. تبقى لتجميد (عند الحاجة).
  6. تدور في الخلايا أسفل نحو 225 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. إزالة طاف.
    1. لsubculturing : resuspend 1.5 × 10 6 خلايا في المتوسط ​​10 مل النوع البري في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة (1.5 × كثافة الخلية 10 5 خلية / مل) ، إضافة G - 418 [0.7 ملغ / مل] ، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع.
    2. لزراعة الخلايا CD40 - B : تحتاج 1.2 × 10 6 خلايا لوحة 6 - جيدا واحدة. Resuspend الخلايا في المتوسط ​​النوع البري في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.1 X 6 10 الخلايا / مل ، وأشرق لهم في 78 غراي. لوحة 2 مل من تعليق خلية في كل بئر واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. استخدام هذه اللوحات المعدة لتنشيط خلايا B عندما tCD40L NIH/3T3 الخلايا هي ملتصقة (على الأقل 4 ساعات : التحقق من الالتزام مع المجهر ، لا تنتظر أكثر من 24 ساعة لبدء الخلية B - التحفيز). (متابعة باء)

B. B - 40 CD خلية ثقافة

أولا إعداد PBMCs لتحفيز - CD40 (يوم 0) :

يرجى ملاحظة : قبل متابعة التأكد من أن الخلايا المغذية هي ملتصقة. إضافة جديدة من الحلول دائما على الفور الى وسط النمو انترلوكين 4 و السيكلوسبورين قبل الاستخدام.

  1. تأخذ PBMCs ، سواء الطازجة أو إذابة مناسب. Resuspend PBMCs مرتين في برنامج تلفزيوني من 50mL 1X لغسلها وتدور باستمرار أول مرة في 265 x ج لمدة 7 دقائق والمرة الثانية في XG 190 لمدة 7 دقائق لإزالة الخلايا الأخرى. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 20 مل من برنامج تلفزيوني. تحديد عدد الخلايا في قسامة لتعليق الخلية.
  2. تدور باستمرار المبلغ المطلوب من الخلايا نحو 225 x ج لمدة 5 دقائق. لوحة 6 - جيدا 4 × 10 6 خلية / كذلك هناك حاجة ، وبالتالي 24 × 10 6 خلية لكل لوحة.
  3. إزالة وطاف في resuspend PBMC في الخلايا 1 × 6 10 / مل في CD40 - B مستنبت استكملت حديثا مع 50 يو / مل من انترلوكين 4 كعامل نمو والسيكلوسبورين 0.63 ميكروغرام / مل وثمرة لمنع الخلايا التائية (تركيزات نظرا تشير إلى واحد مل مستنبت!).
  4. إزالة طاف من 6 جيدا قبل لوحة المحتضنة مع الخلايا NIH/3T3 tCD40L.
  5. غسل ملتصقة tCD40L NIH/3T3 الخلايا مع PBS مل 2 في البئر الأولى والخطوة الثانية مع 2 مل من CD40 - B المتوسطة الغسيل.
  6. إضافة بلطف 4 مل من تعليق PBMC (1 × 10 6 خلية / مل) إلى كل جانب من لوحة 6 - جيدا.
  7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
  8. في يوم 7 ، reculture الخلايا (3.2 متابعة).

II. إعادة الزراعة من CD40 الخلايا البائية (يوم 7 أيام ومن ثم كل 3-4) :

  1. مجموعات حصاد CD40 - B - 6 خلايا من جانب لوحة عن طريق إعادة التعليق مع ماصة 10 مل وتجمع لهم في أنبوب 50 مل.
  2. تدور باستمرار نحو 225 x ج لمدة 7 دقائق واستبدالها تماما طاف مع CD40 - B المتوسطة الغسيل. في حين عد كمية من الخلايا قسامة ، وتدور في الخلايا أسفل نحو 225 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend خلايا CD40 CD40 - B - B في مستنبت بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل.
  3. إضافة حلول جديدة من 4 انترلوكين في تركيز 50 يو / مل و 0.63 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين ألف للمتوسط.
  4. إزالة طاف من لوحة 6 - جيدا قبل المحتضنة مع الخلايا NIH/3T3 tCD40L.
  5. غسل خلايا ملتصقة مع PBS مل 2 في البئر الأولى والخطوة الثانية مع 2 مل من CD40 - B المتوسطة الغسيل.
  6. 6 خلية / مليلتر) من تعليق CD40 - B على كل جانب من لوحة 6 - جيدا.
  7. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
  8. خلايا فرعية في كل 3-4 أيام مرة أخرى في نهاية المطاف مع نقية للغاية خلايا B - CD40 تفعيلها بعد ما مجموعه 14 يوما.

جيم حل المشاكل -- ماذا لو CD40 - B الخلايا لا تنمو؟

  1. هل راجعت للتعبير يجند CD40 الخلايا المغذية؟
  2. وينبغي لوحة متجهة الخلايا المغذية المستخدمة في التحفيز لا يكون أقدم من 24H؟
  3. هو تلوث محتمل مع الميكوبلازما؟
  4. كان الحل انترلوكين - 4 المستخدمة لإذابة مكملات طازجة وكان النشاط المناسب البيولوجي؟
  5. وأضاف السيكلوسبورين A في التركيز الصحيح؟

الشكل 1
الشكل 1. الرجاء النقر هنا لنسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2
الشكل 2. الرجاء النقر هنا لنسخة أكبر من الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics