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Generación de humanos CD40 activado por células B

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

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Abstract

CD40-activa las células B (CD40-células B) se han identificado como una fuente alternativa de presentadoras de antígeno inmuno-estimulantes de las células (APC) para la inmunoterapia del cáncer 1-3. Comparación con las células dendríticas (CDs), la mejor caracterizada APC, las células CD40-B tienen varias propiedades diferentes biológicos y técnicos. Al igual que en los países en desarrollo, las células B muestran un incremento en la expresión de MHC y moléculas co-estimulantes (Fig.1b), muestran una gran capacidad migratoria y la presentación de antígenos presentes de manera eficiente a las células T, después de la estimulación con el ligando interleucina-4 y CD40 (CD40L). Sin embargo, en contraste con los países en desarrollo inmaduro o maduro, las células CD40-B expresan la tríada de los ganglios linfáticos completa mensajeras que consta de CD62L, CCR7/CXCR4, y la función leucocitaria antígeno-1 (LFA1, CD11a/CD18), necesarios para la recalada de los órganos linfoides secundarios (Fig. 1A) 3. Las células CD40-B se puede generar sin problemas de cantidades muy pequeñas de sangre periférica, que puede ser ampliado in vitro a cantidades muy grandes de muy pura CD40-células B (> 10 9 células por paciente) de donantes sanos, así como el cáncer pacientes (Fig. 1c, d) 1,4.

En este protocolo se demuestra cómo obtener completamente activados CD40-células B a partir de PBMC humanos. Moléculas clave para el cultivo de células son CD40 ligando, la interleucina-4 (IL-4) y ciclosporina A (CsA), que se renuevan en un ciclo de día y la cultura 4.3. Para fines de laboratorio CD40-estimulación es proporcionado por NIH/3T3 células que expresan el ligando CD40 humano recombinante (tCD40L NIH/3T3) 5. Para evitar la contaminación con células no transfectadas, la expresión del ligando de CD40 humano en los transfectantes tiene que ser revisado regularmente (Fig. 2).

Después de 14 días CD40-B consisten en cultivos celulares de más del 95% de pureza células B y la expansión de células B CD40-más de 65 días es con frecuencia posible sin ningún tipo de pérdida de la función 1, 4. Las células CD40-B de manera eficiente recoger, procesar y 6 presentan antígenos a las células T. No sólo naϊve principal, sino también ampliar las células T de memoria 7,8. CD40-activa las células B puede ser usado para estudiar la activación de células B, diferenciación y función. Además, representan una herramienta prometedora para la vacunación terapéutica o preventiva contra los tumores 9.

Protocol

El protocolo para la generación de las células B CD40-activado a partir de PBMC se divide en dos partes: la parte A demuestra la preparación de ligando de CD40 que expresa NIH/3T3 células, que se utilizará como células alimentadoras obligado placa. La parte B describe la actual CD40-B cultura.

A. Preparación de las células de alimentación (tCD40L NIH/3T3)

El NIH/3T3 tCD40L es un adherente línea murina de células de fibroblastos, que nunca debe ser totalmente confluente. Las células son por lo tanto, dividido dos veces por semana. El cultivo de más de más de 6 semanas no es recomendable.

  1. Quitar medio de edad de la cultura de primaria con una pipeta estéril y lavar las células con 10 ml de PBS 1x. Aspirar el PBS después del lavado.
  2. Agregar 4 ml de tripsina / EDTA en un matraz de 75 cm 2 durante 5-10 minutos a 37 ° C. Use suaves golpecitos para separar las células.
  3. Agregar 10 ml de medio de tipo salvaje y giro suave.
  4. La transferencia de la suspensión de células en un tubo de 50 ml con una pipeta estéril y el giro de las células hacia abajo a 225 xg durante 5 min.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de tipo salvaje. Cuente el número de células de una parte alícuota de la suspensión celular y preparar tres tubos de 50 ml con el número adecuado de células:
    1. 1,5 x 10 6 células por subcultivo
    2. 0,2 x 10 6 células / pocillo de irradiación utilizadas para el cultivo de células CD40-B
    3. resto de congelar (si es necesario).
  6. Giro de las células hacia abajo a 225 xg durante 5 min.
  7. Eliminar el sobrenadante.
    1. Para subcultivo: resuspender 1,5 x 10 6 células en 10 ml de medio de tipo salvaje en un 75 cm 2 frasco de cultivo celular (densidad celular de 1,5 x 10 5 células / ml), añadir G-418 [0,7 mg / ml] e incubar las células en 37 ° C con 5% de CO 2. Dividir las células dos veces por semana.
    2. Para el cultivo de células CD40-B: Es necesario 1,2 x 10 6 células por uno de 6 pocillos. Resuspender las células en el medio silvestre, con una densidad de 0,1 x 10 6 células / ml e irradiar a los 78 Gy. Placa de 2 ml de la suspensión celular en cada pocillo y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Utilice esta platos preparados para la estimulación de células B cuando tCD40L NIH/3T3 células adherentes (por lo menos 4 horas: comprobar el cumplimiento con el microscopio, no espere más de 24 horas para empezar la estimulación de células B). (Continuar con B.)

B. CD 40-B de cultivo celular

I. Preparación de PBMCs de CD40-estimulación (día 0):

Tenga en cuenta: antes de continuar asegurarse de que las células alimentadoras son adherentes. Siempre agregue nuevas soluciones de interleucina-4 y la ciclosporina A para el medio de cultivo inmediatamente antes del uso.

  1. Tome PBMCs, ya sea fresco o descongelado adecuadamente. Resuspender PBMCs dos veces en 50 ml de PBS 1x para lavar y centrifugar por primera vez a 265 g durante 7 min y una segunda vez a 190 xg durante 7 min para eliminar otras células. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml de PBS. Determinar el número de células en una parte alícuota de la suspensión celular.
  2. Decantar la cantidad necesaria de células en 225 g durante 5 min. Para una placa de 6 pocillos 4 x 10 6 células / así se necesitan, por lo tanto 24 x 10 6 células por placa.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el PBMC a 1 x 10 6 células / ml en CD40-B medio de cultivo fresco suplementado con 50 U / mL de IL-4 como un factor de crecimiento y 0,63 ciclosporina mg / ml A para prevenir la extensión de las células T (Teniendo en cuenta las concentraciones se refieren a un medio de cultivo ml!).
  4. Eliminar el sobrenadante de 6 y placa pre-incubadas con tCD40L NIH/3T3 células.
  5. Lave el adherente tCD40L NIH/3T3 células con 2 ml de PBS por el primer pozo y en una segunda fase con 2 ml de CD40-B medio de lavado.
  6. Suavemente agregar 4 ml de la suspensión de PBMC (1 x 10 6 células / ml) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
  7. Se incuban las células a 37 º C con CO2 al 5%.
  8. El día 7, reculture las células (Continúe con 3.2.).

II. Nueva puesta en cultivo de células CD40-B (día 7, y después cada 3-4 días):

  1. Racimos de la cosecha de células B CD40-de 6 y placa resuspendiendo con una pipeta de 10 ml y la piscina que en un tubo de 50 ml.
  2. Centrifugar a 225 xg durante 7 minutos y sustituir por completo el sobrenadante con CD40-B medio de lavado. Al contar la cantidad de células de una parte alícuota, girar las células hacia abajo a 225 xg durante 5 minutos. Resuspender las células CD40-B CD40-B en el medio de cultivo a una concentración de 1 x 10 6 células / ml.
  3. Añadir nuevas soluciones de interleucina-4 en una concentración de 50 U / mL y 0,63 mg / ml de ciclosporina A en el medio.
  4. Eliminar el sobrenadante de una placa de 6 pocillos pre-incubadas con tCD40L NIH/3T3 células.
  5. Lave las células adherentes con 2 ml de PBS por pocillo primera y en una segunda fase con 2 ml de CD40-B medio de lavado.
  6. 6 células / ml) de suspensión CD40-B a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
  7. Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO 2.
  8. Las células de la subcultura de nuevo cada 3-4 días para terminar con las células humanas de alta pureza B CD40-activa después de un total de 14 días.

C. Solución de problemas - ¿Qué pasa si las células CD40-B no crecen?

  1. ¿Ha revisado para la expresión del ligando CD40 de células alimentadoras?
  2. La placa con destino células alimentadoras utiliza para la estimulación no debe ser mayor de 24 horas?
  3. Es una contaminación por micoplasma es posible?
  4. Era la solución de interleuquina-4 utilizado para la suplementación recién descongelado y tuvo la actividad biológica apropiada?
  5. Se añade la ciclosporina A en la concentración correcta?

Figura 1
Figura 1. Por favor, haga clic aquí para una versión ampliada de la figura 1.

Figura 2
Figura 2. Por favor, haga clic aquí para una versión ampliada de la figura 2.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

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References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

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