Author Produced

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In diesem Video stellen wir Ihnen die

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

CD40-aktivierte B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle für immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für die Immuntherapie von Krebs 3.1 identifiziert worden. Im Vergleich zu Dendritische Zellen (DCs), den am besten charakterisierten APC, CD40-B-Zellen haben mehrere verschiedene biologische und technische Eigenschaften. Ähnlich wie DCs, B-Zellen eine erhöhte Expression von MHC-und kostimulatorischen Molekülen (Abb. 1b) zeigen, weisen eine starke Wanderungsbewegungen Kapazität und präsentieren Antigen-Präsentation effizient auf T-Zellen nach Stimulation mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L). Doch im Gegensatz zu unreifen oder reifen DCs, Express-CD40-B-Zellen die volle Lymphknoten Homing Triade bestehend aus CD62L, CCR7/CXCR4 und Leukozyten-Antigen-Funktion-1 (LFA1, CD11a/CD18), die für Homing zu sekundären lymphatischen Organen (Abb. 1a) 3. CD40-B-Zellen können ohne Schwierigkeiten aus sehr geringen Mengen im peripheren Blut, die weiter in vitro werden, um sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (> 10 9 Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs kann erweitert erzeugt werden Patienten (Fig.1c, d) 1,4.

In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert CD40-B-Zellen aus humanen PBMC erhalten. Key-Moleküle für die Zellkultur sind CD40-Ligand, Interleukin-4 (IL-4) und Cyclosporin A (CsA), die in einer 3-4 Tage alten Kultur-Zyklus wieder aufgefüllt werden. Für Laborzwecke CD40-Stimulation wird durch NIH/3T3-Zellen exprimierenden rekombinanten humanen CD40-Liganden (tCD40L NIH/3T3) 5 zur Verfügung gestellt. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen ist die Expression des humanen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig überprüft werden (Abb.2).

Nach 14 Tagen CD40-B-Zell-Kulturen bestehen aus mehr als 95% reinen B-Zellen sowie eine Ausweitung des CD40-B-Zellen über 65 Tage ist oft möglich, ohne Verlust der Funktion 1, 4. CD40-B-Zellen effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T Zellen 6. Sie haben nicht nur prime naϊve, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen 7,8. CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren 9.

Protocol

Das Protokoll für die Erzeugung von menschlichen CD40-aktivierte B-Zellen aus PBMC ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von CD40-Liganden exprimieren NIH/3T3-Zellen, die als Platten-gebundenen Feeder-Zellen verwendet werden. Teil B beschreibt die eigentliche CD40-B Kultur.

A. Herstellung von Feeder-Zellen (tCD40L NIH/3T3)

Die tCD40L NIH/3T3 ist ein Anhänger murine Fibroblasten-Zelllinie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen.

  1. Entfernen Sie alte Medium aus dem Primär-Kultur mit einer sterilen Pipette und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Saugen Sie das PBS nach dem Waschen.
  2. 4 mL Trypsin / EDTA in einer 75 cm 2-Kolben für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Verwenden leichtes Klopfen auf die Zellen zu lösen.
  3. Fügen Sie 10 ml Wildtyp-mittel-und Schwenk-sanft.
  4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Tube mit einer sterilen Pipette und drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min.
  5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Wildtyp-Medium. Zählen Sie die Zellzahl eines Aliquots der Zellsuspension und bereiten drei 50 ml-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Zellen:
    1. 1,5 x 10 6 Zellen zur Subkultivierung
    2. 0,2 x 10 6 Zellen / well für die Bestrahlung von CD40-B-Zell-Kultur verwendet
    3. Rest einfrieren (falls erforderlich).
  6. Drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min.
  7. Entfernen Sie den Überstand.
    1. Für Subkultivierung: resuspendieren 1,5 x 10 6 Zellen in 10 mL Wildtyp-Medium in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche (Zelldichte 1,5 x 10 5 Zellen / ml), fügen G-418 [0,7 mg / mL] und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Split die Zellen zweimal pro Woche.
    2. Für die CD40-B-Zell-Kultur: Sie müssen 1,2 x 10 6 Zellen für eine 6-Well-Platte. Resuspendieren der Zellen in Wildtyp-Medium mit einer Dichte von 0,1 x 10 6 Zellen / ml und bestrahlen sie bei 78 Gy. Plate 2 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2. Mit diesem vorbereiteten Platten für B-Zell-Stimulation, wenn tCD40L NIH/3T3-Zellen Anhänger sind (mindestens 4 Stunden: check Einhaltung mit dem Mikroskop; warten Sie nicht länger als 24 h auf B-Zell-Stimulation beginnen). (Fahren Sie mit B.)

B. CD 40-B-Zell-Kultur

I. Vorbereitung der PBMCs für CD40-Stimulation (Tag 0):

Bitte beachten Sie: Bevor Sie fortfahren vergewissern, dass Feeder-Zellen adhärent sind. Fügen Sie immer frische Lösungen von Interleukin-4 und Cyclosporin A, um das Wachstum mittelfristig unmittelbar vor dem Gebrauch.

  1. Nehmen PBMCs, entweder frisch oder in geeigneter Weise aufgetaut. Resuspendieren PBMCs zweimal in 50 ml 1x PBS zu waschen und Spin-down ersten Mal bei 265 xg für 7 min und ein zweites Mal bei 190 xg für 7 min zu anderen Zellen zu entfernen. Überstand verwerfen und die Zellen in 20 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Zellsuspension.
  2. Spin down benötigte Menge an Zellen bei 225 xg für 5 min. Für eine 6-Well-Platte 4 x 10 6 Zellen / well benötigt werden, also 24 x 10 6 Zellen pro Platte.
  3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die PBMC mit 1 x 10 6 Zellen / ml in CD40-B Kulturmedium frisch mit 50 U / ml Interleukin-4 ergänzt als Wachstumsfaktor und 0,63 ug / ml Cyclosporin A Auswuchs der T-Zellen zu verhindern (Angesichts Konzentrationen beziehen sich auf ein ml Kulturmedium!).
  4. Entfernen Sie den Überstand aus 6-Well-Platte vorinkubiert mit tCD40L NIH/3T3-Zellen.
  5. Waschen Sie die Anhänger tCD40L NIH/3T3-Zellen mit 2 mL PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium.
  6. Vorsichtig 4 ml PBMC Suspension (1 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
  7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  8. Am Tag 7 reculture der Zellen (Fahren Sie mit 3.2.).

II. Rekultivierung von CD40-B-Zellen (Tag 7 und dann alle 3-4 Tage):

  1. Ernte-Clustern von CD40-B-Zellen aus 6-Well-Platte durch Resuspendieren mit einer 10 mL Pipette und sie gemeinsam in eine 50 ml Tube.
  2. Spin down bei 225 xg für 7 Minuten und vollständig ersetzen den Überstand mit CD40-B Waschmedium. Während des Zählens der Zelle Betrag eines aliquoten, drehen Sie das Zellen nach unten bei 225 xg für 5 Minuten. Resuspendieren CD40-B-Zellen in CD40-B Kulturmedium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
  3. Fügen Sie frische Lösungen von Interleukin-4 in einer Konzentration von 50 U / ml und 0,63 pg / mL Cyclosporin A auf das Medium.
  4. Entfernen Sie den Überstand aus einer 6-well-Platte mit tCD40L NIH/3T3-Zellen vorinkubiert.
  5. Waschen Sie die adhärenten Zellen mit 2 ml PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium.
  6. 6 Zellen / ml) von CD40-B Suspension in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
  7. Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  8. Subculture Zellen wieder alle 3-4 Tage bis zum Ende mit hochreinem humanen CD40-aktivierte B-Zellen nach insgesamt 14 Tagen.

C. Trouble-Shooting - Was passiert, wenn CD40-B-Zellen nicht wachsen?

  1. Haben Sie überprüft, für die CD40-Ligand Expression von Feeder-Zellen?
  2. Die Platte gebundene Nährzellen der Stimulation dürfen nicht älter 24 Stunden?
  3. Ist eine Kontamination mit Mykoplasmen möglich?
  4. War der Interleukin-4-Lösung zur Ergänzung eingesetzt frisch aufgetaut und hatte die entsprechende biologische Aktivität?
  5. War Cyclosporin A aufgenommen in der richtigen Konzentration?

Abbildung 1
Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1.

Abbildung 2
Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 2 dargestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics