Geração de humanos CD40-activated células B

Biology

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

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Abstract

Células CD40-activated B (CD40-células B) foram identificados como uma fonte alternativa de imuno-estimulatórias células apresentadoras de antígenos (APC) para imunoterapia de câncer 1-3. Em comparação com as células dendríticas (DCs), a melhor caracterizada APC, as células CD40-B têm várias propriedades biológicas distintas e técnicos. Semelhante ao DCs, as células B mostram um aumento da expressão de MHC e moléculas co-estimulatórias (Fig.1b), apresentam uma forte capacidade migratória e apresentação de antígenos presentes de forma eficiente para células T, após a estimulação com a interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L). No entanto, em contraste com DCs imaturas ou maduro, as células CD40-B expressar a tríade completa nó de linfa homing consistindo de CD62L, CCR7/CXCR4 e função antígeno leucocitário-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessário para homing para órgãos linfóides secundários (Fig.1a) 3. Células CD40-B pode ser gerado sem dificuldades a partir de quantidades muito pequenas de sangue periférico que pode ser expandida in vitro de quantidades muito grandes de alta-pura-B CD40 células de câncer (> 10 9 células por paciente) de doadores saudáveis, bem como pacientes (Figura 1C, d) 1,4.

Neste protocolo que demonstrar como obter totalmente ativado CD40-B a partir de células PBMC humana. Moléculas-chave para a cultura de células são CD40 ligante, a interleucina-4 (IL-4) e ciclosporina A. (CsA), que são reabastecidos em um ciclo de 3-4 dias de cultura Para fins de laboratório CD40-estimulação é fornecida por células que expressam NIH/3T3 recombinante ligante CD40 humano (tCD40L NIH/3T3) 5. Para evitar a contaminação com os não-transfectadas células, a expressão do ligante CD40 humano no transfectants tem de ser verificados regularmente (Fig.2).

Após 14 dias CD40-B culturas de células consistem de mais de 95% de células B puro e uma expansão de células CD40-B com mais de 65 dias é frequentemente possível, sem qualquer perda de função de 1, 4. Células CD40-B de forma eficiente recolher, processar e apresentar antígenos às células T 6. Eles não só naϊve prime, mas também expandir células T de memória 7,8. Células CD40-B ativado pode ser usado para estudo de células B ativação, diferenciação e função. Além disso, eles representam uma ferramenta promissora para a vacinação preventivo ou terapêutico contra tumores 9.

Protocol

O protocolo para a geração de células CD40-activated B da CMSP é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação de CD40 ligante expressar NIH/3T3 células, que serão usados ​​como células da placa-bound alimentador. Parte B descreve a cultura CD40-B real.

A. Preparação de células alimentadoras (tCD40L NIH/3T3)

O NIH/3T3 tCD40L é uma linha de células aderentes murino de fibroblastos, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.

  1. Remova o meio de idade a partir da cultura primária com uma pipeta estéril e lavar as células com 10 mL de PBS 1x. Aspirar o PBS após a lavagem.
  2. Adicionar 4 mL Tripsina / EDTA em um frasco de 75 cm 2 por 5-10 minutos a 37 ° C. Use tocando suave para retirar as células.
  3. Adicionar 10 mL de meio de tipo selvagem e giratória suavemente.
  4. Transferir a suspensão de células em um tubo de 50 mL com uma pipeta estéril e girar a células para baixo a 225 xg por 5 min.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de meio de tipo selvagem. Conte o número de células de uma alíquota da suspensão de células e preparar três tubos de 50 mL com o número adequado de células:
    1. 1,5 x 10 6 células para subcultura
    2. 0,2 x 10 6 células / poço de irradiação utilizadas para a cultura de células CD40-B
    3. restante para congelar (se necessário).
  6. Spin the células para baixo de 225 xg por 5 min.
  7. Remover o sobrenadante.
    1. Para subcultura: ressuspender 1,5 x 10 6 células em 10 mL de médio tipo selvagem em um frasco de 75 centímetros de cultura de células 2 (densidade celular de 1,5 x 10 5 células / mL), adicione G-418 [0,7 mg / mL] e incubar as células em 37 ° C com 5% de CO 2. Dividir as células duas vezes por semana.
    2. Para a cultura de células CD40-B: Você precisa de 1,2 x 10 6 células para uma placa de 6 poços. Ressuspender as células em meio de tipo selvagem com uma densidade de 0,1 x 10 6 células / mL e irradiar-los em 78 Gy. Placa de 2 mL da suspensão de células em cada poço e incube-os a 37 ° C com 5% de CO 2. Utilize este placas preparado para a estimulação de células B, quando tCD40L NIH/3T3 células são aderente (pelo menos 4 horas: verificar a aderência com o microscópio, não espere mais de 24 h para iniciar a estimulação de células B). (Continue com B.)

B. CD 40-B de cultura de células

I. Elaboração de PBMCs para CD40-estimulação (dia 0):

Por favor note: antes de continuar determinar que as células de alimentação são aderentes. Sempre adicionar novas soluções de interleucina-4 e ciclosporina A para o meio de crescimento imediatamente antes da utilização.

  1. Tome PBMCs, fresco ou descongelado adequadamente. Ressuspender PBMCs duas vezes em 50mL de PBS 1x para lavá-los e spin down primeira vez em 265 xg por 7 min e uma segunda vez em xg 190 para 7 min para remover outras células. Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de PBS. Determinar o número de células em uma alíquota da suspensão de células.
  2. Spin down quantidade necessária de células em 225 xg por 5 min. Para uma placa de 6 poços 4 x 10 6 células / poço são necessários, portanto, 24 x 10 6 células por placa.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender o CMSP em 1 x 10 6 células / mL em CD40-B meio de cultura fresco suplementado com 50 U / mL de IL-4 como fator de crescimento e 0,63 ciclosporina mcg / mL para evitar A conseqüência de células T (concentrações indicados referem-se a um meio de cultura mL!).
  4. Remover o sobrenadante de 6 bem-placa pré-incubadas com tCD40L NIH/3T3 células.
  5. Lavar o aderente tCD40L NIH/3T3 células com 2 mL de PBS por poço em primeiro lugar e em uma segunda etapa com 2 mL de CD40-B médio de lavar roupa.
  6. Delicadamente adicionar 4 mL de suspensão PBMC (1 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
  7. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2.
  8. No dia 7, reculture as células (Continue com o 3.2.).

II. Recultivo de CD40 células-B (7 º dia e depois a cada 3-4 dias):

  1. Clusters de colheita de células CD40-B a partir de 6 bem-chapa pela ressuspensão com uma pipeta de 10 mL e piscina-los em um tubo de 50 mL.
  2. Girar a 225 xg por 7 minutos e substituir completamente o sobrenadante com CD40-B médio de lavar roupa. Contando a quantidade de células de uma alíquota, gire a células para baixo a 225 xg por 5 minutos. Ressuspender as células CD40-CD40-B em B meio de cultura a uma concentração de 1 x 10 6 células / mL.
  3. Adicionar novas soluções de interleucina-4 em uma concentração de 50 U / mL e 0,63 ciclosporina mcg / mL A ao meio.
  4. Remover o sobrenadante de uma placa de 6 poços de pré-incubadas com tCD40L NIH/3T3 células.
  5. Lave as células aderentes com 2 mL de PBS por poço em primeiro lugar e em uma segunda etapa com 2 mL de CD40-B médio de lavar roupa.
  6. 6 células / mL) de suspensão CD40-B a cada poço da placa de 6 poços.
  7. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2.
  8. Células subcultura novamente a cada 3-4 dias para acabar com alta pureza células CD40-B ativadas após um total de 14 dias.

C. Resolução de problemas - O que se as células CD40-B não crescem?

  1. Você tem verificado para CD40 ligante expressão de células de alimentação?
  2. A placa-bound células alimentadoras usado para a estimulação não deve ser mais de 24h?
  3. É uma possível contaminação com micoplasma?
  4. Foi a solução interleucina-4 utilizada para a suplementação recém descongeladas e tiveram a atividade biológico adequado?
  5. Ciclosporina A foi adicionado na concentração correta?

Figura 1
Figura 1. Por favor, clique aqui para uma versão maior da figura 1.

Figura 2
Figura 2. Por favor, clique aqui para uma versão maior da figura 2.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

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