Génération de l'homme CD40-B activés cellules

Biology

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

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Abstract

CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été identifiés comme une source alternative de l'immuno-stimulation des cellules présentatrices d'antigènes (APC) pour l'immunothérapie du cancer 1-3. Comparé aux cellules dendritiques (CD), la meilleure APC caractérisée, les cellules CD40-B ont plusieurs propriétés biologiques distinctes et techniques. Similaires aux PED, les cellules B montrent une augmentation de l'expression du CMH et des molécules de co-stimulation (Fig. 1b), présentent une forte capacité migratoire et la présentation des antigènes présents efficacement aux cellules T, après stimulation par un ligand interleukine-4 et CD40 (CD40L). Cependant, contrairement aux CD immatures ou matures, les cellules CD40-B expriment la triade lymphatiques pleine noeud homing composé de CD62L, CCR7/CXCR4, et la fonction des leucocytes antigènes-1 (LFA1, CD11a/CD18), nécessaires à tête chercheuse d'organes lymphoïdes secondaires (Fig.1a) 3. Cellules CD40-B peuvent être générés sans difficultés à partir de très petites quantités de sang périphérique qui peut être élargi in vitro à de très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (> 10 9 cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que le cancer patients (Fig.1c, d) 1,4.

Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé CD40-B à partir des cellules PBMC humaines. Molécules clés pour la culture cellulaire sont CD40-ligand, l'interleukine-4 (IL-4) et la cyclosporine A. (CSA), qui sont reconstituées dans un cycle de culture de 3-4 jours Aux fins de laboratoire CD40-stimulation est fournie par des cellules exprimant NIH/3T3 humaine recombinante ligand CD40 (tCD40L NIH/3T3) 5. Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l'expression du ligand CD40 humaine sur les transfectants doit être vérifié régulièrement (Fig.2).

Après 14 jours de CD40-B cultures cellulaires consistent de plus de 95% de cellules B pur et une expansion des cellules CD40-B de plus de 65 jours est souvent possible sans aucune perte de fonction 1, 4. Cellules CD40-B efficacement relever, traiter et présenter les antigènes aux cellules T 6. Ils ne sont pas seulement naϊve écoute, mais également d'élargir les cellules T mémoire 7,8. CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B, la différenciation et la fonction. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs 9.

Protocol

Le protocole pour la génération des cellules B CD40 humains activés à partir des PBMC est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation du ligand CD40 exprimant cellules NIH/3T3, qui sera utilisée comme plaque de cellules nourricières lié. Partie B décrit les réelles CD40-B de la culture.

A. Préparation de cellules nourricières (tCD40L NIH/3T3)

Le NIH/3T3 tCD40L est une adhérente lignée murine de cellules fibroblastes, qui ne devrait jamais devenir complètement confluentes. Les cellules sont donc découpé deux fois par semaine. La culture sur plus de six semaines n'est pas recommandée.

  1. Retirer ancien milieu de la culture primaire avec une pipette stérile et laver les cellules avec 10 ml de PBS 1x. Aspirer le PBS après le lavage.
  2. Ajouter 4 ml de trypsine / EDTA dans un flacon de 75 cm2 pendant 5-10 minutes à 37 ° C. Utilisez tapotant doucement pour détacher les cellules.
  3. Ajouter 10 ml de milieu de type sauvage et pivotant doucement.
  4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml avec une pipette stérile et le spin des cellules vers le bas à 225 xg pendant 5 min.
  5. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 10 mL de milieu de type sauvage. Comptez le nombre de cellules d'une aliquote de la suspension cellulaire et préparer trois tubes de 50 ml avec le nombre approprié de cellules:
    1. 1,5 x 10 6 cellules pour repiquage
    2. 0,2 x 10 6 cellules / puits pour l'irradiation utilisée pour la culture de cellules CD40-B
    3. restant à geler (si nécessaire).
  6. Faites tourner les cellules vers le bas à 225 xg pendant 5 min.
  7. Enlever le surnageant.
    1. Pour repiquage: resuspendre 1,5 x 10 6 cellules dans 10 ml de type moyenne sauvages dans un flacon de 75 cm2 de culture de cellules (1,5 densité cellulaire x 10 5 cellules / mL), ajouter G-418 [0,7 mg / ml] et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Fractionner les cellules deux fois par semaine.
    2. Pour la culture de cellules CD40-B: Vous avez besoin de 1,2 x 10 6 cellules pour une plaque de 6 puits. Resuspendre les cellules dans un milieu de type sauvage à une densité de 0,1 x 10 6 cellules / ml et les irradier à 78 Gy. Planche 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits et les incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez cette assiettes préparées pour la stimulation des lymphocytes B lors tCD40L cellules NIH/3T3 sont adhérentes (au moins 4 heures: vérifier l'adhérence avec le microscope, ne pas attendre plus de 24 h pour commencer la stimulation des lymphocytes B). (Continuer avec B.)

B. CD 40-B de culture cellulaire

I. Préparation des PBMC pour CD40-stimulation (jour 0):

S'il vous plaît noter: avant de continuer de s'assurer que les cellules nourricières sont adhérentes. Toujours ajouter de nouvelles solutions de l'interleukine-4 et la cyclosporine A au milieu de croissance immédiatement avant utilisation.

  1. Prenez PBMC, frais ou décongelés de façon appropriée. Resuspendre PBMC deux fois dans 50 ml de PBS 1x pour les laver et de spin-down première fois à 265 xg pendant 7 min et une seconde fois à 190 xg pendant 7 min pour éliminer d'autres cellules. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 20 ml de PBS. Déterminer le nombre de cellules dans une aliquote de la suspension cellulaire.
  2. Isoler quantité requise de cellules à 225 xg pendant 5 min. Pour une plaque à 6 puits 4 x 10 6 cellules / puits sont nécessaires, donc 24 x 10 6 cellules par plaque.
  3. Enlever le surnageant et remettre en suspension les PBMC à 1 x 10 6 cellules / ml dans le CD40-B milieu de culture fraîchement supplémenté avec 50 U / ml d'interleukine-4 comme un facteur de croissance et de 0,63 g / mL cyclosporine A pour prévenir la excroissance de cellules T (Compte tenu de la concentration se référer à un milieu de culture ml!).
  4. Retirer le surnageant de 6 puits plaque pré-incubées avec des cellules NIH/3T3 tCD40L.
  5. Laver les adhérents tCD40L cellules NIH/3T3 avec 2 ml de PBS par puits d'abord et dans une seconde étape avec 2 ml de milieu B CD40-linge.
  6. Ajouter délicatement 4 ml de suspension PBMC (1 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits.
  7. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  8. Au jour 7, les cellules reculture (Continuez à 3.2.).

II. Remise en culture des cellules B CD40 (7 jours, puis tous les 3-4 jours):

  1. La récolte des grappes CD40 des cellules B à partir de 6 puits plaque par remise en suspension avec une pipette de 10 ml et de les mettre dans un tube de 50 ml.
  2. Isoler à 225 xg pendant 7 minutes et remplacer complètement le surnageant avec CD40-B milieu de lavage. Alors que le comptage des cellules du montant d'une aliquote, tourner les cellules vers le bas à 225 xg pendant 5 minutes. Resuspendre les cellules CD40-CD40-B en B milieu de culture à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml.
  3. Ajouter de nouvelles solutions de l'interleukine-4 à une concentration de 50 U / ml et 0,63 mg / ml de cyclosporine A dans le milieu.
  4. Retirer le surnageant dans une plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules NIH/3T3 tCD40L.
  5. Laver les cellules adhérentes avec 2 ml de PBS par puits d'abord et dans une seconde étape avec 2 ml de milieu B CD40-linge.
  6. 6 cellules / ml) de suspension CD40-B pour chaque puits de la plaque à 6 puits.
  7. Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  8. Repiquer les cellules à nouveau tous les 3-4 jours pour finir avec très pure des cellules B CD40-activé après un total de 14 jours.

C. Dépannage - Que faire si les cellules CD40-B ne poussent pas?

  1. Avez-vous vérifié l'expression du ligand CD40 des cellules nourricières?
  2. La plaque lié cellules nourricières utilisé pour la stimulation ne doit pas être âgés de plus de 24h?
  3. Est-ce une contamination par des mycoplasmes possibles?
  4. Était la solution interleukine-4 utilisé pour la supplémentation fraîchement dégelé et avait l'activité biologique approprié?
  5. Cyclosporine A a été ajoutée dans la concentration correcte?

Figure 1
Figure 1. S'il vous plaît cliquez ici pour une version agrandie de la figure 1.

Figure 2
Figure 2. S'il vous plaît cliquez ici pour une version agrandie de la figure 2.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

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