대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

Biology

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Summary

계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.

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Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

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Abstract

자연 미생물의 대부분은 현재 전통적인 재배 방식에 액세스할 수 남아 있습니다. 지난 10 년간, 문화, 독립적인 환경 게놈 (

Protocol

Fosmid 라이브러리 구축은 네 가지 주요 단계와 여러 부분 (개요에 대한 Fig.1 참조)로 하위 분할로 나뉘어있다.

([3] "0.22 μm의 Sterivex 필터에서 DNA 추출"프로토콜을 참조) I 단계

1 부 : 효소 - 촉매 세포 용해

2 부 : CsCl 밀도 기울기 원심 분리와 DNA의 회복에 의해 환경의 DNA 정제

파트 3 : 겔 전기 영동에 의해 추출한 DNA의 품질 관리

단계 II

1 부 : 복구 환경의 DNA 효소 수정 단계

환경 DNA의 최종 수리 단계에 필요한 모든 시약은 EPICENTRE에서 pCC1 Fosmid 라이브러리 제작 키트에 포함되어 있습니다. 이상적으로, 당신의 게놈 DNA는 0.5 μg / μl로 조정해야합니다.

  1. 얼음의 모든 시약을 녹여 다음을 조합하여 간략하게 아래에 모든 액체를 얻을 수있는 튜브를 원심 분리기 :
    • X μl 멸균 물
    • 8 μl 10X 최종 수리 버퍼
    • 8 μl dNTP 2.5 MM 믹스
    • 8 μl 10 MM ATP
    • 최대 20 μg가 삽입 DNA를 (~ 0.5 μg / μl) 빠졌어
    • 4 μl 최종 수리 효소 믹스
    • 80 μl 총 반응 부피
  2. 최대 60 분, 열 70에서 효소 혼합을 inactivate 45 분 최소 시간 실온에서 품어 ° 10 분 (평균 시간에, 최종 수리의 후속 사이즈 선택에 대한 낮은 용해 아가로 오스 젤 준비를위한 C DNA는) 아래를 참조하십시오.

2 부 : 펄스 - 필드 겔 전기 영동 (PFGE)의 게놈 DNA의 크기 선택

  1. 버퍼를 실행 1.0X 태의 150 ML에서 낮은 용해 아가로 오스의 1.5 g을 다시 정지와 작은 자기 저어 막대를 추가합니다. microwavable 플라스틱 랩으로 술병을 차지하고 있으며 아가로 오스가 완전히 해산 때까지 전자 레인지에 신속하게 끓여. 그것은 겔 트레이에 부어 정도로 추워 때까지 솔루션을 저어 (~ 60 ° C).
    참고 : 젤 또는 실행중인 버퍼 중 ethidium의 브로마이드 또는 SYBR 골드 포함되지 않습니다.
  2. 귀하의 젤을 캐스팅 한 광석 투 웰스 (로딩 버퍼의 80 μl 플러스 적절한 금액)으로 전체 최종 수리 믹스를 읽어 당신에게 충분한 공간을 제공합니다 빗를 선택 겔 트레이를 조립.
  3. 전기 챔버에 1.0X 태의 2.2 L를 붓고하고 실행 버퍼를 순환 기계의 전원을 켜고 14 ° C.에 냉각 장치를 설정 펌프는 실행중인 버퍼의 충분한 순환을 보장하기 위해 70 RPM에서 실행하고 14에서 버퍼를 보관해야 ° C.
  4. 그것이 냉각되면 잘 파괴 표면에 겔 트레이에 녹아 아가로 오스를 붓고하고 거품을 피하 있는지 확인하십시오. 녹은 아가로 오스도 겔 빗에 있는지 확인합니다, 그렇지 않으면 빗를 제거하고 용해 아가로 오스로 돌려 놔. 젤이 확정되면, 빗를 제거하고 미드 레인지 내가 젤의 네 번째 우물에 마커를 PFG을로드합니다. 압출 성형 겔 주사기의 아가로 오스하고 메스로 끝에서 작은 플러그를 슬라이스. 잘 전면에 플러그를 놓고 용융 아가로 오스와 인감. 전기 챔버에 젤를 놓습니다.
    참고 : 쉽게 매우 신중하게 낮은 용융 젤 브레이크로 아가로 오스 겔을 취급하고 있습니다. 당신이 젤 실어 ° C 전에 실행 버퍼가 14 식었 있는지 확인하십시오. 당신의 우물은 아가로 오스에 의해 차단 보면 다음 다음 시간을보십시오 : 당신은 겔에서 빗를 제거하기 전에, 빗 주위에 1-2 ML 태 버퍼를 추가,이 멋진 웰스가 발생합니다.
  5. λ HindIII 소화의 첫 잘 하중 5 μl의 fosmid 컨트롤 크기 표식 1 μl (EPICENTRE, 100 μl / NG)로 따라갔다. microcentrifuge 관의 크기 마커뿐만 아니라 로딩 버퍼의 적절한 금액 멸균 물 10 μl를 추가합니다. 큰 볼륨은 쉽게 젤을 로드할 수 있습니다. 직접 fosmid 마커 옆에 부하 최종 - 수리 로딩 버퍼의 적절한 양의 열을 inactivated 섞는다. 뚜껑과 프로그램 설정을 닫습니다.
    참고 : 우리가 정말 대략 DNA의 양을 계량하거나 게놈 DNA의 전단의 범위를 시각화하기 위해 다른 DNA를 사다리의 다른 양의 로딩하는 것이 좋습니다. 이상적인 크기의 표식이 λ DNA - HindIII 다이제스트와 미드 레인지 I PFG 마커 (코에서 모두)입니다.
  6. 프로그램 설정 : 사용 자동 알고리즘하여 PFGE 시스템이 장착된 경우. 이 프로그램은 자동으로 특정 크기 범위의 DNA를 분리하는 데 필요한 설정을 계산합니다. 사용 설정은 다음과 같습니다 DNA의 크기 범위는 2-250 KB, 교정 계수 : 1, 기울기 : [6 V / cm]; 런타임 : 12:00 시간; 포함 각도 : 120 °, 초기 전환 시간 : 0.1 초, 최종 스위칭 시간 : 21.79 초, 올렸 계수 = 선형.
  7. 당신의 DNA를 시각화하기 위해, 용기에 1.0X 태 버퍼 250 ML 잔하고 10.000X SYBR 골드 25 μl를 추가하며,이 용액에 겔을 배치하기 전에 가볍게 섞는다. SYBR 골드 민감한 빛 같은 어둠 속에서 1 H에 대한 겔 스테인.
    참고 : 처리garose 젤은 매우 신중하게 낮은 용해 젤 쉽게 브레이크로.

파트 3 : 회복의 DNA 겔 추출과 결합하여 fosmid 복제 벡터에 DNA 복구

이 부분에 대한 모든 시약은 EPICENTRE fosmid 라이브러리 제작 키트에 포함되어 있습니다.

  1. 그 동안 70 물 목욕을 준비 ° C 45 °에 한 겔 소화 단계를위한 C.이
  2. 빈 tared microcentrifuge 관과 푸른 조명 transilluminator로 멸균 메스와 함께 귀하의 스테인드 젤 가져가라. 귀하의 최종 수리 게놈 DNA와 fosmid 컨트롤 크기 마커를 시각화. fosmid 컨트롤 크기 마커의 위치 (폭 5~7밀리미터입니다 엑사이스 젤 슬라이스)과 약간 이상 마이 그 레이션 및 tared microcentrifuge 관에 슬라​​이스를 전송하는 메스와 엑사이스 젤 슬라이스. 미드 레인지 이것이 당신이 너무 높이 젤 잘라하지 않도록 도움으로 당신의 겔에서 마커를 PFG를 실행합니다.
    참고 : 교차 오염을 방지하고 푸른 빛이 켜기 전에 볼 수 안경을 착용 그것에 젤 리기 전에 블루 라이트 transilluminator에서 플라스틱 랩하다. 이 원치 않는 키메라 클론집니다로 게놈 DNA가 fosmid 컨트롤의 크기 표시보다 작은 엑사이스 겔 조각은하지 마십시오.
    당신은 각각의 전체 게놈 샷건이나 BAC 라이브러리를 구축 낮거나 높은 분자량의 DNA를 포함하는 겔 조각 잘라 저장할 수 있습니다.
    스톱 I : 회복 겔 슬라이스 (들)은 최대 한 년 -20 ° C에 저장할 수 있습니다
  3. tared 튜브를 저울질하고 겔 슬라이스 (들)의 무게를 계산합니다. 아가로 오스 1 MG는 녹은 아가로 오스의 약 1 μl를 얻을 것입니다.
  4. 70 ° 10-15분에 대한 C (우리가 gelase 버퍼를 추가하지.)에서 물을 욕조에서 게놈 DNA를 포함하는 낮은 녹는 아가로 오스를 용융 귀하의 겔 슬라이스가 완전히 녹인 후, 45 신속하게 튜브를 전송 ° C.
    참고 : 와동 샘플을이 전단 DNA를 수도로 용해 도움하지 않습니다.
  5. 녹은 아가로 오스 100 μl 당 GELase 효소 준비 1 U (1μl)를 추가합니다. 1 시간 동안 45 ° C에서 부화 후 더 GELase (2-4 μl)을 추가하고 추가 시간 동안 부화. 70 GELase 효소 준비 inactivate 가열 ° 10 분 C.
    10 분 얼음에 튜브를 삽입하고 펠렛 모든 불용성 입자 15 분 최대 속도 (13,000 RPM)에서 튜브를 원심 분리기. 조심스럽게 상단 표면에 뜨는를 제거하고 15 ML 팔콘 튜브로 전송 관에 멸균 물 3 ML를 추가합니다.
    참고 : 모든 pelleted 아가로 오스를 pipetting하지 마십시오. 우리는 키트 별도로 주문하기 추가 GELase 효소 준비에 포함된보다 GELase를 추가로.
  6. Ultracel - 10 멤브레인와 Amicon 울트라 - 4 원심 필터 유닛에 대한 해결책을 전송하고 6~8분에 대한 4,000그램에서 튜브를 돌려서을 통해 흐름을 폐기. 필터 솔루션의 금액이 약 100 감소 때까지 원심 분리기 ~ 500 μl합니다. 위에서 빈 팰컨 관에 멸균 물의 다른 세 ML을 추가하고 Amicon 튜브에 대한 해결책을 전송하고 원심 분리 단계를 반복합니다. 물 3 ML과 세 번이나 씻고 다시 통해 흐름을 폐기. 100 μl - 50 최종 볼륨을 줄입니다.
    참고 : 우리가 원심 분리 단계를위한 스윙 버킷 로터를 사용하여, 간단히 원심 분리하는 동안 제자리에 고정하기 위해 50 ML 팔콘 튜브에 Amicon 원심 필터 장치를 놓으십시오. Amicon 필터는 안전하게 확장 원심 분리 후에도 필터에 대한 솔루션을 50 μl을 유지합니다.
  7. 미리 씻어 Microcon YM - 50 원심 필터 단위로 Amicon 관에서 남아있는 DNA 솔루션을 전송하고 모든 DNA를 복구하기 위해 멸균 물의 추가 50 μl로 Amicon 튜브를 헹굴. 원심 분리기 Microcon YM - 50 10,000그램에서 microcentrifuge에서 원심 필터 단위 필터가 여전히 약간 액체로 덮여 때까지. 액체의 단지 소량이 필터에 남아있다면 매 순간을 확인합니다. 필터 뒤집어를 켜고 새로운 microcentrifuge 관에서 3 분 1,000그램에서 두 번째 원심 분리 단계하여 DNA의 솔루션을 복구합니다. 결과 볼륨 총 10-15 μl을 초과하지 말아야하고, 그렇지 않으면 당신의 DNA도 내고 단계에서 희석 수 있습니다.
    참고 : 건조를 완료하는 필터 장치를 회전하지 않도록주의합니다. 귀하의 멤브레인가 건조되면, 멤브레인에 10-15 μl 물을 추가 30 초 동안 부드럽게 선동하고 위에 설명된대로 귀하의 DNA를 복구합니다.
  8. NanoDrop 또는 PicoGreen 분석하여 결과 DNA 솔루션을 계량.
  9. 복구된 최종 수리 DNA 지금 pCC1 - fosmid 복제 벡터에 출혈도 잡았 될 준비가 된 것입니다. 얼음에 다음과 같은 솔루션을 해동하고 어금니 비율을 삽입하는 벡터 10시 1분 있는지 확인하십시오.
    참고 : 0.5 μg pCC1 - fosmid 벡터 ~ 0.09 pmoles 벡터.
    ~ 40 KB 삽입 DNA ~ 0.009 pmoles 삽입 DNA의 0.25 μg
    도금은 E. 감염 후 몇 fosmid 클론을 얻을해야하는 경우 결합 단계에서 사용되는 DNA의 양을 늘리면 도움이 될 수 있습니다 에 대한 대장균 세포선택 번호판입니다.

    아래의 순서로 시약을 추가하고 간략하게, 하단에 모든 액체를 얻을 수있는 튜브를 원심 튜브를 누르고 다시 스핀 :

    • X μl 멸균 물
    • 1 μl 10X 빠른 링크 내고 버퍼
    • 1 μl 10 MM ATP
    • 1 μl pCC1 - fosmid 벡터 (0.5 μg / μl)
    • X μl 집중 삽입 DNA (0.25 μg)
    • 1 μl 빠른 링크의 DNA ligase
    • 10 μl 총 반응 부피
  10. 2 시간 동안 실온에서 품어 70 10 분 동안 효소를 inactivate 열 ° C.
    II 중지 : 저장 내고 혼합물 -20 ° C에서하거나 파지 패키징 단계를 진행합니다.
    참고 : 단일 결합 반응은 환경 DNA의 품질에 따라 10 3 -10 6 클론을 생산합니다. 특정 범위에 필요한 클론의 추정 번호에 따라, 당신은 결합 반응을 확장할 수 있습니다. 결합이 최대 크기를 조정하는 경우 아래에 설명된대로, 다음 파지 포장 추출물의 양은 따라 최대 크기를 조정해야합니다.

단계 III

1 부 : 벡터 삽입 내고 제품의 파지 - 포장

  1. 의도 파지 포장 승리가 37 박 이상의 일반 LB 판과 부화에 EPI300 - T1 R 도금 스트레인을 제공 2-3 일 전에 ° C가 하나의 식민지를 얻을 수 있습니다. 이 번호판은 4 ° C 나중에 사용하기 위해 봉인하고 저장할 수 있습니다.
  2. LB의 국물의 패키징 반응 예방 50 ML 전날 + 10 MM MgSO 4 단계 1에서 생성된 접시의 하나의 식민지와 함께 (500 μl 1M MgSO 4 추가). 225 RPM 37 ° C 하룻밤에 흔들어.
  3. 포장 반응의 하루 2 단계에서 준비한 숙박 문화의 5 ML 신선한 50 ML의 LB의 국물 + 10 MM MgSO 4 예방. 1.0-0.8의 OD 600-37 ° C에서 성장과 1.0 OD 600을 초과하지 마! 당신이 정확한 결과를 얻을 수 있도록 분광 광도계에 측정하기 전에 샘플을 희석. 자세한 사용 ° C까지 얼음 또는 4 저장소 세포.
    참고 : III를 중지 : 문화 필요한 경우 최대 72 시간으로 4 ° C에 저장된 수 있지만 새로운 성장 문화를 사용하는 것은 매우 좋습니다.
  4. 해동은 얼음에, 모든 결합 반응에 대한 MaxPlax 람다 포장 추출물, 1 관 이전에 수행. 해동은 10-15분 소요됩니다. 한편, 미리 차게하는 얼음 1.5 ML 튜브를 놓습니다.
    참고 : 너무 오래 얼음에 해동 파지를 남겨하지 않습니다. 그렇지 않으면 파지 감염 효율이 떨어질 것이다.
  5. 일단 해동 즉시 두 번째 미리 차게 1.5 ML의 microfuge 관과 얼음 곳으로 각 포장 추출물 25 μl를 전송합니다. 80 ° C. - 남아있는 포장 추출물로 돌아가기
    참고 : 드라이 아이스 또는 다른 CO 2 소스와 함께 포장 추출 보관하지 마십시오.
  6. 얼음 해동 추출물의 각 25 μl에 결합 반응 10 μl를 추가합니다. 솔루션 여러 번 pipetting으로 혼합, 공기 방울을 도입하지 마십시오. 간단히 튜브의 바닥에 모든 액체를하고 30 ° C 90 분에 대한 포장 반응을 부화 튜브를 원심 분리기. 얼음 포장 추출물을 나머지 배양 해동 80 분 후.
    참고 : 30 ° C의 배양 단계에 물 목욕보다는 가열 블록을 사용합니다.
  7. 90 분 포장 반응이 완료되면 각 반응 관에 포장 추출물의 나머지 25 μl를 추가합니다. 30 추가 90 분 품어 반응 ° C. 90 분 보육 각 포장 튜브의 준비 파지 희석 버퍼 100 μl를 추가하고 부드럽게 혼합 후.
    참고 : 효율 끝에 낮은되어야하는 경우, 귀하의 파지 추출물이 너무 오래있을 또는 드라이 아이스 또는 다른 CO 2 소스에 노출되었습니다. 우리의 경험에서는, 30에서 2 시간 동안 최종 추가 부화 다음 대신 30 ° C의 실온 (2 회 90 분)에 파지의 포장 ° C는 결과 클론의 양을 증가했다.
  8. 부드럽게 튜브에 165 μl의 총 볼륨의 결과로 각각의 튜브와 섞어 클로로포름 5 μl를 추가합니다. 점성 침전물은 클로로포름 추가 후 양식 수 있으며,이 라이브러리의 생산에 영향을주지 않습니다. 파지 입자를 pipetting 할 때 그러나이 침전물뿐만 아니라 유기 클로로포름 단계를 사용하지 마십시오.
    IV를 중지 :이 시점에서 포장 파지 입자는 4 며칠 ° C. 위해 저장될 수 있습니다
    참고 : 최고의 파지의 감염 효율을위한, 갓 포장 파지를 사용합니다.

2 부 : 도서관 호스트 E.의 감염 대장균

  1. 파지 입자의 매 10 μl에 대한 EPI300 - T1 R 전지 400 μl의 비율에 EPI300 - T1 R 호스트 세포 (OD 600 = 0.8-1.0)로 포장 파지를 추가합니다. 우리가 포장 파지 입자 및 준비 EPI300 - T1 R 호스트 세포의 5 ML 125 μl를 사용하는 클로로포름을 pipetting 피하기 위해. 37 품어 부드럽게 믹스와 ° C를 30 분.
    참고 : 파지 포장 튜브에서 파지 입자를 제거하면 호스트 세포에 클로로포름을 전송하지 않도록주의합니다. 잘 모르겠 으면, 포장 파지 입자의 적은을.

파트 3 : 도금 및 titering

  1. 네 작은 LB + 12.5 μg / ML chloramphenicol 배양 접시에 5-7 소독 유리 구슬을 추가합니다.
  2. 두 번 50 μl 두 개의 4 배 별도의 접시에 EPI300 - T1 R 세포를 감염 파지 10 μl을 확산. 확산도 보장하기 위해, 파지에 감염된 세포의 10 μl로 접시 몇 가지 LB의 수프 (~ 50 μl)을 추가합니다. 수평으로 균일하게 접시에있는 세포를 밖으로 확산 판 흔들어. 15 분 접시가 건조 해 그리고 반전 접시로 비즈를 제거합니다.
    참고 :이 접시가 transformants의 수를 결정하기 위해 너무 높은 식민지 밀도를 피하기 위해 식민지 따기 단계에서 필요한 적절한 dilutions를 계산하는 데 사용됩니다.
  3. 식민지 양식까지 48 시간 16-24시간 위해 거꾸로 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. 네이버 식민지로 성장의 빠른 성장 클론을 방지하기 위해 24 시간 후에 접시를 확인합니다.
  4. 한편, 4 10 분 3,500그램 ° C.에서 원심 분리하여 5 ML 감염에서 - 남은 잔여 세포를 수확 뜨는 폐기하십시오. 튜브 1 ML의 LB / 20 % 글리세롤을 추가합니다. 다시 중지 세포 펠렛과 나누어지는 그 100 μl 2 ML cryovial 튜브의 각. 즉시 고정 및 -80 ° C에서 저장하는 단계를 따기 식민지에서 추가 사용.
  5. 다음날, 접시에 클론의 수를 계산하고 titer를 결정합니다. fosmid - 클론의 총 금액을 계산하는 정확한 희석 요소를 포함되었는지 확인합니다.
    참고 :이 절차는 총 10,000 50,000 fosmid - 클론 사이에서 생성되지만 3000 사이의 범위를 최대 80,000 fosmid의 클론이 관찰이며, 압축을 푼 환경 DNA의 품질과 순도에 따라 다릅니다.

단계 IV

1 부 : 아가르 - 잘 접시 준비

  1. 다음과 같이 접시에 미디어를 붓고, ML의 LB 당 12.5 μg의 chloramphenicol을 포함 :
    • 100X15mm 배양 접시 : 25mL LB 한천
    • 150X15mm 배양 접시 : 50mL LB 한천
    • 245X245mm 스퀘어 bioassay 플레이트 : 250mL LB 한천
    참고 : 접시에 걸쳐 균일하게 한천의 깊이를 만들기 위해 잘 파괴 표면에 미디어를 부어하는 것이 중요합니다. 우리는 많은 접시를 처리하지 않아도 그렇게 fosmid 라이브러리 245X245 mm 접시를 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 귀하의 글리세롤 재고가 얼음위에 준비된 fosmid 클론을 포함 해동. 귀하의 계산 titer에 따라 사용하려는 접시에 적절한 금액을 확산 (글리세롤 주식을 준비하는 것은 또한 당신의 세포 ~ 5 배 집중). 세포 성장을위한 배양 시간은 37 24 시간입니다 ° C.
    스톱 V : 그들은 식민지 따기 단계에서 사용되는 때까지 식민지가 형성되면, 최대 1 개월 4 ° C에서 봉인 한천 플레이트를 저장합니다.
    참고 : 식민지들이 서로로부터 멀리 골고루 충분히 펼쳐해야하고 직경 약 1mm 성장을해야합니다. 유리 구슬을 사용하여 세포를 도금하는 것은 식민지 사이 좋은 분리를 생성할 수 있습니다. 100X15mm 페트리 접시에, 보통 150 ~ 250 식민지가 최고의 로봇 따기 효율을위한 22 X 22cm 좋은 밀도 있으며, 더 이상 2,000 식민지는 취득해서는 안됩니다.
  3. 식민지 따기의 일, -80에서 12.5 μg의 ML의 국물 당 chloramphenicol뿐만 아니라 도서관 스토리지에 20 % 글리세롤로 보충 LB의 국물 ° C. 가득 96 또는 384 잘 접시를 준비 아래에 설명된뿐만 아니라 접시는 자동 QFill3 판 충전 시스템으로 채워지게된다.
  4. 유리병의 압력솥 2 세트 (500 ML), 뚜껑 및 실리콘 튜브. 바늘 조립 및 장착 플랜지를 포함하지 압력솥 매니폴드를 마십시오. 알콜 램프의 불꽃 근처 또는 멸균 환경을 만들고 유지하는 후드 내에서 QFill3 조립.
    참고 : 실리콘 튜브가 핀치 밸브 활성을 눌러 완전히 밸브에 튜브를 슬라이딩하여 핀치 밸브에 삽입되었는지 확인합니다. (다음 열 매체를 분배를위한 브레이크처럼 작동합니다.)
  5. 한 번에 ~ 50 DH 2 O를 autoclaved 1 % 표백제의 ML, 그리고 80 % 에탄올 하나의 통과에 의해 분배 바늘을 소독하고 폐기물 솔루션을 수집하는 플랫폼에 팁 상자 뚜껑을 놓으십시오. 살균 후, 병, 뚜껑 및 실리콘 튜브로 구성된 다른 설정으로 변경.
  6. ~ 300 ML 매체와 병을 입력합니다. 청소 단계에서 남아있는 에탄올의 제거를 통해 중간 정도로 실행합니다. 관이 청소되면, 플랫폼에 384분의 96 잘 접시를로드합니다. 접시를 채우기 위해 "시작"을 누르면, 각 잘 준비 LB의 국물 200 μl 가득해야합니다. 깨끗한 분배 바늘하려면,을 통해 80 % 에탄올의 ~ 50 ML을 실행합니다.
    참고 : 잘 접시를 작성하기 전에 레이블이 있는지 확인하십시오.

2 부 : 식민지 따기 로봇 설치

  1. 우리는 로봇 QPix2 교류를 따기 복제를 사용하는사용자의 설명서를 cording. 사용자는 자신의 로봇을 다루는 방법과 최고의 수확 효율성을 보장하기 위해 최선을 설정할 알고 있어야합니다.
  2. 복제 따기 주변 살균 환경을 만들려면 30 분 동안 자외선을 켭니다. UV 표시등이 켜져있는 동안, 1 %의 표백제 500 ML, 살균 DH 2 O 500 ML 80 % 에탄올 500 ML을 준비합니다. 표시로 자외선이 종료할 때 해제 트레이를 입력합니다. 항상 올바르게 표시 솔루션 쟁반에 솔루션을 부어. 뒤에서 앞으로 DH 2 O와 전면 트레이에 80 % 에탄올을 autoclaved 다음, 1 %의 표백제를 입력합니다. 그들이 가득 있는지 확인합니다. 피킹 바늘은 충분한 세척 솔루션없이 제대로 씻어 수 없습니다.
    참고 : 시간이 지남에 따라 모니터의 80 % 에탄올. 그것은 증발 최대 얹어해야합니다.
  3. 최적 따기 대한 매개 변수를 설정 후, fosmid 클론 및 Q - PIX 작업 영역에서 게시물 사이 잘 접시와 함께 준비 한천 접시를 놓습니다. 당신은 모든 접시가 꺼져 커버 찍은 있는지 확인!
  4. 플레이트 바로 앞에서 코너에 대한 꽉해야하므로 수확 중에 이동할 수 없습니다. 다음 전면 패널을 닫습니다.
    참고 : 이것은 매우 중요합니다!
  5. 일단 모든 매개 변수는 따기 절차는 시작 설정됩니다. 모든 따기가 완료되면 건조하기 위해 벤치에 탈이온수와 세트로 브러쉬와 쟁반 린스. 발생했을 수있는 유출을 정리하고, 80 % 에탄올과 Q - PIX 안쪽을 닦으십시오.

파트 3 : 숙박 인큐베이션 및 라이브러리 저장

  1. 모든 글리세롤 주식 번호판이 붙어 있구 있는지 확인하고, 24 시간 동안 37 ° C 배양기에서 그들을 놓으십시오. 날짜, incubated 접시의 수를, 부화 시간, 제거 시간과 이니셜이 들어있는 인큐베이터에 메모를 남겨주세요.
  2. 오랫동안 저장을 위해, -80 ° C의 냉동고에 성장 야간 incubations 넣어.

대표 결과 :

소개 프로토콜은 방법을 주어진 환경에서 미생물 사회의 유전 내용을 캡처하는 환경 fosmid 라이브러리를 생성하는 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 샘플 환경의 유전 콘텐츠 대표하고 전체 절차의 끝에 얻은 fosmid 클론의 양이 너무 낮으면 독자가 중요한 단계를 수정하고 최적화하도록해야 fosmid 라이브러리를 만들어야합니다.

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Discussion

절차는 가장 효율적으로 해안 물 샘플에서 파생된 게놈 DNA와 큰 삽입 fosmid 라이브러리를 생성하는 방법을 설명합니다. 업 - 스트림 게놈의 DNA 추출은 별도의 프로토콜 [3]에 설명되어 있습니다.

fosmid 라이브러리 생산 다단계 프로세스, 계획 네 명 모두 제공 단계를 포함하여 모든 절차에 시간에 최소한 2~3주 때문입니다. 게놈 DNA의 추출은 가장 중요한 단계와 단계를 추출한 게놈 DNA의 품질과 수량에 의존하는 모든 다운 스트림이며 때문에이 단계에 대한 충분한 시간을 보내는 고려하여 신중하게 작동합니다. 품질 및 추출한 DNA의 수량 조절은 매우 중요합니다. 이것이 당신이 만들려고하는 첫번째 라이브러리 특히 그것은 fosmid 클론의 숫자가 낮은 것을 발생할 수 있습니다. 자체 fosmid 라이브러리 건설 정직 한, 실패는 주로 귀하의 추출 및 정제 게놈 DNA의 부족 품질 및 / 또는 수량에 의해 발생합니다. 게놈 DNA를 다시 추출하여 도서관 공사가 성공적으로 완료되지 않은 경우에는 정화 및 DNA 복구에 관련된 단계에 특별한 관심을 지불하는 것을 고려하십시오.

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Disclosures

나는 공개 없어요.

Acknowledgments

우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT와 SL은 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 장학금으로 지원했다. MT 또한 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 화목 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

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