Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik çevre genomik DNA izole bir fosmid kütüphane inşaatı açıklanmıştır. Çıkan klon kütüphanesi 384-kuyucuğu içine aldı ve mansap sıralama ve fonksiyonel tarama, otomatik bir koloni toplama sistemi uygulama tarafından arşivlenir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Doğada mikropların büyük bir çoğunluğu şu anda, geleneksel tarım yöntemleri erişilemez kalır. Geçtiğimiz on yıl boyunca, kültür-bağımsız çevre genomik (

Protocol

Fosmid kütüphane yapımı dört ana adımları ve çeşitli parçalar (genel bir bakış için bkz: Şekil 1) alt gruplara ayrılmaktadır ayrılmıştır .

Adım ([3] "0.22 mcM Sterivex filtreler DNA ekstraksiyonu" protokol bakın)

Bölüm 1: Enzim-katalizli hücre parçalama

Bölüm 2: CSCL yoğunluk gradiyenti santrifüj ve DNA kurtarma çevre DNA saflaştırılması

Bölüm 3: Kalite kontrol edilen DNA jel elektroforezi ile

Adım II.

Bölüm 1: kurtarıldı çevre DNA'nın Enzimatik değişiklik adımları.

Çevre DNA sonu-onarım adım için gerekli tüm reaktifler Epicentre pCC1 Fosmid Kütüphane Üretim Seti'nde dahildir. İdeal olarak, genomik DNA, 0.5 mg / ml 'ye ayarlanmalıdır.

  1. Buz üzerinde bütün reaktifler çözülme, aşağıdaki birleştirin ve kısaca tüm sıvı altına almak için tüp santrifüj:
    • x ul steril su
    • 8 ul 10X son-onarım tampon
    • 8 ul 2.5 mM dNTP karışımı
    • 8 ul 10 mM ATP
    • 20 mg kadar insert DNA (~ 0.5 mg / ml) makaslanmış
    • 4 ul sonunda tamir enzim karışımı
    • 80 ul toplam reaksiyon hacmi
  2. 60 dakika ve ısı 70 enzim karışımı inaktive kadar en az 45 dakikalık bir süre oda sıcaklığında inkübe ° C de 10 dakika (ortalama süre sonunda tamir sonraki boyutu seçimi için düşük erime agaroz jel hazırlamak için DNA, aşağıya bakınız).

Bölüm 2: pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) genomik DNA Boyut seçim

  1. 150 mL 1,0 TAE tampon çalışan 1.5 g agaroz düşük erime yeniden askıya alma ve küçük bir manyetik karıştırıcı ekleyin. Mikrodalgaya plastik wrap ile şişesi Kapak ve agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada hızlı kaynatın. Çözüm yeterince soğuk jel tepsiye dökün kadar karıştırın (~ 60 ° C).
    Not: jel veya çalışan tampon ya etidyum bromür veya SYBR Altın içermez.
  2. Jel dökme ve tam sonuna-onarım karışımı bir cevher iki kuyu (80 ul artı uygun miktarda yükleme tamponu) içine yüklemek için yeterli alan verecek bir tarak seçmek için jel tepsisi birleştirin.
  3. Elektroforez odasına 2.2 L 1,0 TAE dökün ve makine üzerinde çalışan tampon dolaşmaya açmak ve 14 ° C'ye kadar soğutma cihazı Pompa çalışan tampon yeterli dolaşımını sağlamak için 70 rpm hızında çalışacak ve 14 tampon tutmak ° C.
  4. Soğuduktan sonra iyi tesviye yüzeyi erimiş agaroz jel tepsiye dökün ve kabarcıkları önlemek emin olun. Erimiş agaroz jel tarağı bile emin olun, aksi takdirde tarak kaldırmak ve erimiş agaroz içine geri koymak. Sonra jel katılaşmış, tarak kaldırmak ve jel dördüncü iyi işaretleyici PFG, orta seviyede bir yük. Extrude agaroz jel şırınga ve sonunda bir bistüri ile küçük bir fiş dilim. Iyi ön fiş yerleştirin ve erimiş agaroz ile mühür. Jel elektroforez odasına yerleştirin.
    Not: çok dikkatli düşük erime jeller fren kolayca agaroz jel ele. Jel yükleme başlar çalışan tampon 14 ° C önce soğutulur olup olmadığını kontrol edin. Kuyu agaroz tarafından bloke bakacak olursak, aşağıdaki dahaki sefere deneyin: jel tarak çıkarmadan önce, tarak yaklaşık 1-2 ml TAE-tampon eklemek; bu güzel kuyular neden olacaktır.
  5. Λ HindIII sindirimi ilk iyi yük 5 ul fosmid kontrol boyutu marker 1 ul (Epicentre, 100 ng / ul) izledi. Bir mikrosantrifüj tüp içinde boyut işareti yanı sıra, uygun bir miktarda yükleme tamponu 10 ul steril su ekleyin. Büyük hacimli, daha kolay jel yüklemek için hale getirir. Doğrudan fosmid marker sonraki yük sonunda tamir ve yükleme tamponu uygun bir miktarda ısı ile inaktive edilmiş karışımı. Kapak ve program ayarları kapatın.
    Not: biz gerçekten kabaca DNA miktarını ölçmek için ya da diğer DNA merdiven genomik DNA kesme ölçüde görselleştirmek için farklı miktarlarda yükleme öneririz. Ideal boyut işaretleri λ DNA HindIII Digest ve orta kademe I PFG Marker (her ikisi de NEB).
  6. Program ayarları: Otomatik algoritması kullanın PFGE sistemi ile donatılmıştır. Bu program, size verilen bir boyut aralığı DNA ayırmak için gereken ayarı otomatik olarak hesaplar. Kullanılan Ayarlar: DNA boyut aralığı 2-250 Kb; kalibrasyon faktörü: 1; degrade: [6 V / cm]; çalışma süresi: 12:00; dahil açısı: 120 °, ilk geçiş süresi: 0.1 sn, son anahtarlama : 21.79 sn; Ramping faktörü = lineer.
  7. DNA görselleştirmek için, 250 mL 1,0 TAE tampon bir kabın içine dökün ve 10.000X SYBR Altın 25 ul eklemek; jel çözüm içine yerleştirmeden önce hafifçe karıştırın. SYBR Altın ışığa karşı hassastır, karanlıkta 1 saat jel Leke.
    Not: sizin bir tanıtıcıgarose jel çok dikkatli bir şekilde düşük erime jeller kolay freni gibi.

Bölüm 3: jel çıkarma ve atık DNA ligasyonu ile fosmid klonlama vektör DNA kurtarma

Bu bölümde tüm reaktifler Epicentre fosmid-kütüphane üretim kiti dahildir.

  1. Bu arada bir su banyosu hazırlamak 70 ° C ve 45 ° C jel sindirim adım.
  2. Lekeli jel, boş bir tared mikrosantrifüj tüp ve mavi ışık transilluminator'de için steril bir neşter ile birlikte ele alalım. Son tamir genomik DNA ve fosmid kontrol boyut işareti gözünüzde canlandırın. Fosmid kontrol boyutu marker pozisyonlar (tüketim, 5-7 mm geniş bir jel dilim) ve biraz üstünde göç ve tared mikrosantrifüj tüp dilim aktardığınız bir neşter ile Vergi jel dilim. Bu çok yüksek jel kesmeyin yardımcı olarak jel üzerinde Marker PFG bir orta kademe çalıştırın.
    Not: plastik wrap, çapraz bulaşmayı önlemek ve mavi ışık açmadan önce izleme gözlük için jel koymak önce mavi ışık transilluminator'de yatıyordu. Bu istenmeyen kimerik klonlar sonucu olarak genomik DNA fosmid kontrol boyut işareti daha küçük tüketim jel dilim etmeyin.
    Tüm genom av tüfeği veya BAC kütüphaneleri oluşturmak için sırasıyla, düşük veya yüksek molekül ağırlığı DNA içeren jel dilim kesmek ve saklayabilirsiniz.
    Dur: kurtarılan jel dilim (ler), bir yıla kadar -20 ° C'de saklanabilir
  3. Tared tüpler tartılır ve jel dilim (ler) in ağırlığı hesaplamak. Agaroz 1 mg erimiş agaroz yaklaşık 1 ul verecektir.
  4. Bir su banyosunda 70 ° C 10-15 dakika (gelase tampon katmayan). Genomik DNA içeren düşük erime agaroz eritin Sonra jel dilim tamamen erimiş, 45 hızlı tüp transfer ° C
    Not: vorteks numunenin bu kayma DNA'nızın erime yardımcı yoktur.
  5. 100 ul erimiş agaroz başına GELase Enzim Hazırlık 1 U (1μl) ekleyin. 1 saat süreyle 45 ° C'de inkübe edin ve daha sonra daha fazla GELase (2-4 ul) ekleyin ve bir saat boyunca inkübe edin. Isı GELase Enzim Hazırlık inaktive 70 ° C de 10 dakika.
    10 dakika süreyle buz tüpü yerleştirin ve pelet herhangi bir çözünemez partiküller için 15 dakika maksimum hızda (13.000 rpm) tüp santrifüj. Dikkatle üst süpernatant kaldırmak ve 15 ml Falcon tüp transferi ve tüpe 3 ml steril su ekleyin.
    Not: Herhangi bir pelet agaroz pipetleme kaçının. Kiti, ayrı ayrı sırayla ekstra GELase Enzim Hazırlama daha GELase ekleyin.
  6. Ultracel-10 membran ile bir Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Ünitesi çözüm aktarın ve 6-8 dakika boyunca 4.000 g tüp spin ve akış atmak. Filtre çözüm miktarı yaklaşık 100 kadar Santrifüj ~ 500 ul. Yukarıdaki boş Falcon tüpüne başka bir 3 mL steril su ekleyin ve çözüm Amicon tüp transferi ve santrifüj adımı tekrarlayın. 3 ml su ile yıkayın ve üçüncü kez tekrar üzerinden akış atın. 100 ul - 50 son hacmi azaltın.
    Not: santrifüj basamağı için sallanan bir kova rotor kullanır; santrifüj sırasında bir yerde tutmak için 50 ml Falcon tüp Amicon santrifüj filtre ünitesi yerleştirebilirsiniz. Amicon filtre güvenle sonra bile uzun santrifüj filtre çözüm 50 ul korur.
  7. Önceden yıkanmış Microcon YM-50 Santrifüj Filtre Ünitesi Amicon tüp kalan DNA çözümü transferi ve Amicon tüp tüm DNA kurtarmak için ek 50 ul steril su ile durulayın. Santrifüj Microcon YM-50 10.000 g mikrosantrifüj Santrifüj filtre Filtre Ünitesi hala biraz sıvı ile kaplıdır kadar. Sadece küçük bir miktar sıvı filtre bırakılırsa her dakika kontrol edin. Filtre baş aşağı çevirin ve 3 dakika, yeni bir mikrosantrifüj tüp içinde 1,000 g ikinci bir santrifüj adım DNA çözüm kurtarmak. Hacmi toplam 10-15 ul geçmemelidir, aksi takdirde DNA çok ligasyonu adım sulandırılmış olabilir.
    Not: kuruluk tamamlamak için filtre cihazı spin dikkatli olun. Membran kuru ise, daha sonra, membran üzerine 10-15 ul su ekleyip 30 saniye hafifçe ajitasyon ve yukarıda açıklandığı gibi DNA kurtarmak.
  8. NanoDrop veya PicoGreen tahlil tarafından elde edilen DNA çözümü sayısal olmalıdır.
  9. Kurtarılan son tamir DNA pCC1 fosmid klonlama vektörü bağlandı olmaya hazır. Buz üzerinde aşağıdaki çözüm çözülme ve molar oranını eklemek için vektör 10:01 olduğundan emin olun.
    Not: 0.5 mg pCC1 fosmid vektör ~ 0.09 pmoles vektör.
    ~ 40 Kb insert DNA ~ 0.009 pmoles eklemek DNA 0.25 mikrogram
    Kaplama E. enfekte sonra sadece birkaç fosmid klonlar almalıdır ligasyonu adımda kullanılan DNA miktarını artırmak yararlı olabilir üzerindeki coli hücrelerindeseçim plakalar.

    Reaktifler aşağıdaki sırayla ekleyin ve kısaca altındaki tüm sıvı almak için tüp santrifüj tüp dokunun ve tekrar dönmeye:

    • x ul steril su
    • 1 ul 10X Fast-Link ligasyonu tampon
    • 1 ul 10 mM ATP
    • 1 ul pCC1 fosmid vektör (0.5 mg / ml)
    • x ul konsantre eklemek DNA (0.25 mcg)
    • 1 ul Fast-Link DNA ligaz
    • 10 ul toplam reaksiyon hacmi
  10. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve 10 dakika boyunca enzim inaktive ısı 70 ° C
    II Dur: mağaza ligasyon karışımı, -20 ° C'de veya faj ambalaj adıma geçin.
    Not: Bir tek ligasyon reaksiyonu çevre DNA kalitesine bağlı olarak 10 3 -10 6 klonları üretecektir. Klonların özellikle kapsama alanı için gerekli tahmini sayısı dayanarak, ligasyon reaksiyonu büyütmek. Ligasyonu ölçekli ise aşağıda açıklandığı gibi, daha sonra faj ambalaj özü miktarı buna göre büyütülüyor olmalıdır.

Adım III.

Bölüm 1: Faj-vektör-insert ligasyonu ürün ambalaj

  1. Amaçlanan faj ambalaj çizgi dışında iki ya da üç gün önce 37 gece boyunca düz bir LB plaka ve inkübe EPI300-T1 R kaplama gerginlik ° C tek koloniler elde etmek için. Bu plaka, kapalı ve 4 ° C ileride kullanmak üzere saklanabilir.
  2. LB suyu ambalaj tepki inokülasyon 50 ml önceki gün + 10 mM MgSO 4 1. adımda oluşturulan plaka tek koloni (500 ul 1M MgSO 4 ekleyin). 225 rpm ve 37 ° C gecede çalkalayınız.
  3. Ambalaj reaksiyonlar gün taze 50 ml LB suyu + 10 mM MgSO 4 5 ml 2. adımda hazırlanan gecede kültür inokule. 1,0 0,8 bir OD 600 37 ° C'de 1.0 büyüyecek ve OD 600 aşmaması! Spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırınız. Buz üzerinde veya 4 ° C kadar daha fazla kullanılan Mağaza hücreleri.
    Not: III Stop: kültür gerekirse 4 ° C'de 72 saat saklanabilir, ancak taze yetişen kültür kullanarak şiddetle tavsiye edilir.
  4. Çözülme, buz üzerinde, her ligasyonu reaksiyon için MaxPlax Lambda Ambalaj ayıklar, 1 tüp önceden yürütülmektedir. Çözülme 10-15 dakika sürecektir. Bu arada, önceden soğutulmuş buz üzerinde 1.5 ml tüp yeri.
    Not: buz üzerinde çözülmüş faj çok uzun süre bırakmayın. Aksi takdirde faj enfeksiyonu verimliliği düşer.
  5. Bir kez çözdürülmelidir hemen ikinci bir ön-soğutulmuş 1,5 mL mikrofuge'de tüp ve buz üzerinde yer her ambalaj ekstresi 25 ul transfer. 80 ° C - Kalan ambalaj özü dön
    Not: kuru buz veya diğer herhangi bir CO 2 kaynağı ile ambalaj muhafaza edilir.
  6. Ligasyonu reaksiyon buz çözülmüş özler her 25 ul 10 ul ekleyin. Çözüm birkaç kez pipetleme Mix, hava kabarcıkları almaktan kaçınması. Kısaca tüm sıvı tüp altına almak ve 30 ° C de 90 dakika inkübe ambalaj reaksiyonlar tüpler santrifüj. Inkübasyon çözülme, buz üzerinde ambalaj özü kalan 80 dakika sonra.
    Not: 30 ° C inkübasyon adım için bir su banyosunda ısıtma bloğu yerine kullanabilirsiniz.
  7. Her reaksiyon tüpüne 90 dakika ambalaj reaksiyon tamamlandıktan sonra kalan 25 ul ambalaj özü ekleyin. Ek 90 dakika süre ile inkübe reaksiyonlar 30 ° C 90 dakika inkübasyon her ambalaj tüp içinde hazırlanan Faj Sulandırma Tamponu 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın.
    Not: verimliliği sonunda düşük olması gerekir, faj özleri çok eski olabilir veya kuru buz veya diğer herhangi bir CO 2 kaynağı maruz kalmıştır. Bizim tecrübelerimize göre, son bir ek inkübasyon tarafından 2 saat 30 yerine 30 ° C oda sıcaklığında (90 dakika) 2 kez faj ambalaj ° C çıkan klonlar miktarı arttı.
  8. Her tüp ve karışımı yavaşça tüp içinde toplam hacmi 165 ul kloroform 5 ul ekleyin. Viskoz bir çökelti kloroform Ayrıca sonra oluşabilir; bu kütüphane üretimi ile engel olmaz. Faj partiküllerinin pipetleme Ancak bu çökelti yanı sıra organik kloroform fazı kaçının.
    Dur IV: Bu noktada ambalajlı faj parçacıkları, birkaç gün 4 ° C saklanabilir
    Not: En iyi faj enfeksiyonu verimliliği için, taze paketlenmiş faj kullanın.

Bölüm 2: kütüphane ev sahibi E. Enfeksiyon coli

  1. 400 ul faj partiküllerinin her 10 ul EPI300-T1 R hücrelerinin oranı paketlenmiş faj EPI300-T1 R konak hücrelerine (OD 600 = 0.8-1.0) ekleyin. Biz paketlenmiş faj parçacıkları ve hazırlanan EPI300-T1 R konak hücrelerine 5 ml 125 ul kullanan herhangi bir kloroform pipetleme önlemek için. 37 inkübe yavaşça karıştırınız ve ° C 30 dk.
    Not: faj ambalaj tüpten faj partikül kaldırdığınızda konak hücreleri için kloroform aktarmak için dikkatli olun. Eğer emin değilseniz, paketlenmiş faj partiküllerinin daha kısa sürer.

Bölüm 3: Kaplama ve titering

  1. Dört küçük LB + 12.5 mg / ml kloramfenikol petri kaplarına 5-7 steril cam boncuk ekleyin.
  2. Iki kez 50 ul ve iki kez dört ayrı plaka EPI300-T1 R hücreleri enfekte faj 10 ul yayıldı. Yayılmasını bile emin olmak için, faj enfekte hücreleri 10 ul plakaları bazı LB suyu (~ 50 ul) ekleyin. Yatay plaka üzerinde eşit şekilde hücrelere yaymak için plaka çalkalayınız. Plaka 15 dakika kurumasını bekleyin ve sonra tersini plaka boncuk kaldırmak.
    Not: bu levhaların transformants sayısı tespit etmek ve koloni toplama adım, çok yüksek koloni yoğunluğu önlemek için gerekli uygun dilüsyonları hesaplamak için kullanılır.
  3. Koloni oluştururlar kadar 48 saat 16 ila 24 saat boyunca baş aşağı 37 ° C inkübatör plakaları yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 24 saat sonra komşu koloniler halinde büyüyen hızlı büyüyen klonlar önlemek için plakaları kontrol edin.
  4. Bu arada, 4 10 dakika boyunca 3.500 g ° C santrifüj 5 ml enfeksiyon arta kalan kalan hücreler hasat Süpernatantı atın. Tüpüne 1 ml LB /% 20 gliserol ekleyin. Yeniden askıya hücre pelet ve kısım 100 ul her 2 mL cryovial tüpler. Hemen dondurun ve -80 ° C toplama koloni adım ileride kullanmak için mağaza.
  5. Ertesi gün, plakalar klonların sayısını ve titresi belirlemek. Fosmid klonların toplam miktarı hesaplamak için doğru seyreltme faktörü dahil etmek için emin olun.
    Not: Bu prosedürü, toplam 10.000 ve 50.000 fosmid-klonlar arasında oluşturur; ancak 3.000 arasında bir dizi kadar 80.000 fosmid klonlar görülmektedir bağlı olarak çıkarılan çevre DNA kalite ve saflık.

Adım IV.

Bölüm 1: Agar ve plakaları hazırlık

  1. Aşağıdaki gibi tabak içine dökün medya; ml LB başına 12.5 mg kloramfenikol:
    • 100x15mm petri: 25ml LB agar
    • 150X15mm petri: 50ml LB agar
    • 245X245mm kare biyoassay plaka: 250 ml LB agar
    Not: plaka eşit olarak agar derinliği iyi düzeyde yüzey medya dökmek için önemlidir. Biz birçok plakaları işlemek zorunda kalmazsınız fosmid kütüphaneler için 245X245 mm plaka kullanmanızı öneririz.
  2. Gliserol stok buz üzerinde hazırlanan fosmid klonlar içeren çözülme. Hesaplanır titresi dayalı kullanmak istediğiniz plaka için uygun olan miktarı Spread (gliserol stok hazırlama ek hücreleri ~ 5 kat konsantreleri). Hücre büyümesi için Kuluçka süresi, 24 saat 37 ° C
    V Dur: koloni alarak adım kadar koloniler, bir ay kadar 4 ° C'de kapalı agar plaklarına depolamak.
    Not: koloniler, eşit birbirinden uzak yeterince yayılmış olması gerekir ve yaklaşık 1 mm çapında büyümek gerekir. Cam boncuklar kullanarak hücrelerin Kaplama koloniler arasında iyi bir ayırım üretebilirsiniz. 100x15mm bir Petri kabı, genellikle 150 ~ 250 koloniler yüksek robot toplama verimliliği için iyi bir yoğunluk ve 22 x 22 cm, 2.000 'den fazla koloniler elde edilmelidir.
  3. Koloni toplama gün, -80 ml suyu başına 12,5 mg kloramfenikol yanı sıra kütüphane depolama için% 20 gliserol ile desteklenmiş LB suyu ° C ile dolu 96 veya 384 kuyucuğu hazırlamak Aşağıda açıklandığı gibi kuyucuğu QFill3 plaka otomatik dolum sistemi ile doldurulur.
  4. Cam şişe Otoklav 2 adet (500 ml), kapaklar ve silikon tüp. Iğne montaj ve montaj flanşı dahil olmak üzere otoklav manifoldu. Bunsen beki alev yakınında ya da steril bir ortam oluşturmak ve korumak için bir başlık içinde QFill3 birleştirin.
    Not: silikon tüp kaptırılmamasına aktivatör basarak ve boru vanası tam sürgülü kaptırılmamasına takılı olduğundan emin olun. (Bu, bir sonraki sütunun orta dağıtım bir fren gibi çalışır).
  5. ~ 50% 1 lik çamaşır suyu dH 2 O otoklava mL ve% 80 etanol, tek bir seferde geçerek dağıtım iğneler sterilize ve atık çözümleri toplamak için platform üzerinde bir ipucu kutusunun kapağını yerleştirin . Sterilizasyon sonrasında, şişe, kapak ve silikon tüp oluşan diğer ayarlamak için değiştirin.
  6. ~ 300 ml medium ile şişe doldurun. Temizlik adım kalan etanol kurtulmak kadar orta yeterli çalıştırın. Hortumun temizlendikten sonra, platform üzerinde 96/384 plaka yükleyin. Plaka doldurmak için "start" tuşuna basın; her bir kuyunun 200 ul hazırlanan LB suyu ile dolu olmalıdır. Temiz dağıtım iğneler aracılığıyla ~ 50 ml% 80 etanol çalıştırın.
    Not: plaka doldurmadan önce etiketli olduğundan emin olun.

Bölüm 2: koloni toplama robotu kurulumu

  1. Biz robot QPix2 ac toplama klon kullanıyorsanızkullanıcı kılavuzuna veya yavaşlar. Kullanıcılar kendi robot yol tutuşu ve yüksek toplama verimliliği garanti altına almak için her şeyi nasıl kurmak için bilgi sahibi olması gerekir.
  2. Klon toplama alanı çevresinde steril bir ortam oluşturmak için, 30 dakika boyunca UV ışığı açın. UV ışık açık iken,% 1 oranında çamaşır suyu, 500 mL, 500 mL steril dH 2 O ve 500 ml% 80 etanol hazırlar. Etiketli olarak UV ışık kapandığında kapalı tepsi doldurun. Her zaman doğru etiketli çözüm tepsilerine çözümleri dökün. Arka ön dH 2 O ve% 80 etanol ön tepsi otoklava sonra,% 1 çamaşır doldurun. Tam dolu olduğundan emin olun. Toplama iğne yeterli yıkama solüsyonu olmadan düzgün yıkanamaz.
    Not:% 80 etanol zamanla monitör. Buharlaşması ve takviye gerekiyor.
  3. En iyi seçmek için parametreleri ayarladıktan sonra, fosmid klonları ve Q-Pix çalışma alanında yazılar arasında iyi plakalar ile hazırlanan agar plaklarına yerleştirin. Plaka kapalı kapsar almış emin olun!
  4. Plakaların sağ ön köşesine karşı sıkı olmalı, bu nedenle toplama sırasında hareket edemez. Sonra ön paneli kapatın.
    Not: Bu son derece önemlidir!
  5. Tüm parametreleri çekme işlemi başlayabilir. Tüm toplama işlemi tamamlandığında kuru bankta deiyonize su ve set ile fırçalar ve tepsileri durulayın. Meydana gelmiş olabilir herhangi bir dökülmeleri Temizlik ve% 80 etanol ile Q-Pix içinde aşağı doğru silin.

Bölüm 3: Gecelik kuluçka ve kütüphane depolama

  1. Tüm gliserol stok plakaları etiketli olduğundan emin olun, ve 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör koyun. Inkübatör tarihinden inkübe plakaların sayısı, kuluçka süresi, kaldırma zamanı ve adınızın baş harflerini içeren bir not bırakın.
  2. Uzun süre saklanması için yetiştirilen bir gecede inkubasyon, -80 ° C derin dondurucuya koyun.

Temsilcisi Sonuçlar:

Sunulan protokol nasıl bir mikrobiyal topluluğun genetik içeriği belirli bir yaşam alanı yakalamak için çevre fosmid kütüphane oluşturmak için prosedürü açıklar. Bu protokol, örneklenen ortamında genetik içerik temsilcisi ve tüm prosedürü sonunda elde edilen fosmid klonlar miktarı çok düşükse okuyucu kritik adımlar değiştirebilir ve optimize etmek için etkinleştirmeniz gerekir fosmid kitaplığı oluşturmak gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir prosedür nasıl bir kıyı su numunesi elde edilen genomik DNA ile büyük bir takın fosmid kütüphane oluşturmak için en verimli şekilde açıklanmıştır. Up-stream genomik DNA ekstraksiyonu ayrı bir protokol [3] açıklanmıştır.

Fosmid-kütüphane üretim çok adımlı bir süreç, planı dört sunulan adımları da dahil olmak üzere tüm prosedürü için en az 2-3 hafta süre. Genomik DNA ekstraksiyonu, en önemli adım ve tüm aşağı akım adımları çıkarılan genomik DNA nitelik ve nicelik güveniyor; böylece bu adım için yeterli zaman harcama göz önünde bulundurun ve dikkatli bir çalışma. Kalite ve miktar kontrolü edilen DNA çok önemlidir. Bu ilk kütüphane yapacağız özellikle fosmid klonlar sayısının düşük olduğunu ortaya çıkabilir. Kendisi tarafından fosmid kütüphane inşaat yalındır, başarısızlık, esas ayıklanır ve saflaştırılmış genomik DNA yeterli kalite ve / veya miktar neden. Genomik DNA yeniden özü ve kütüphane inşaatı başarılı değilse, arıtma ve DNA-kurtarma ilgili adımları özel dikkat düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ifşa etmek için hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. MT ve SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi burs tarafından desteklenmiştir. MT de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) burs desteği aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics