Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement

Biology

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Summary

Construction d'une bibliothèque fosmide avec l'ADN génomique environnementale isolé du continuum profondeur verticale d'un fjord saisonnière hypoxiques est décrite. La bibliothèque clone résultant est capté dans les plaques 384 puits et archivées pour le séquençage et l'aval de criblage fonctionnel par l'application d'un système de picking colonie automatisés.

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Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

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Abstract

La grande majorité des microbes dans la nature restent actuellement inaccessibles aux méthodes de culture traditionnelles. Au cours des dix dernières années, la culture indépendante génomique environnementale (

Protocol

Construction de la bibliothèque fosmide a été divisé en quatre étapes principales et sous-divisé en plusieurs parties (voir Fig.1 pour un aperçu).

Etape I (voir "l'extraction d'ADN à partir de 0,22 uM filtres Sterivex« protocole [3])

Partie 1: lyse cellulaire catalysée par une enzyme

Partie 2: Purification de l'ADN de l'environnement par centrifugation en gradient de densité de CsCl et de récupération de l'ADN

Partie 3: Contrôle de la qualité de l'ADN extrait par électrophorèse sur gel

Étape II

Partie 1: étapes de modification enzymatique de l'ADN récupéré sur l'environnement

Tous les réactifs nécessaires à l'étape de fin de réparation de l'ADN de l'environnement sont incluses dans le kit de pCC1 fosmide production bibliothèque d'Epicentre. Idéalement, votre ADN génomique devrait être ajusté à 0,5 pg / pl.

  1. Décongeler tous les réactifs sur la glace, mélanger les éléments suivants et centrifuger brièvement le tube pour obtenir tout le liquide vers le bas:
    • x de l'eau stérile, ul
    • 8 pl 10X fin de réparation du tampon
    • 8 pl 2,5 mM dNTP mélange
    • 8 pl 10 mM d'ATP
    • jusqu'à 20 mg cisaillé insert d'ADN (~ 0,5 pg / pl)
    • 4 mix ul enzyme fin de réparation
    • 80 le volume total de réaction ul
  2. Incuber à température ambiante pendant une durée minimale de 45 minutes jusqu'à 60 minutes et la chaleur inactiver le mélange enzymatique à 70 ° C pendant 10 min (dans le même temps, préparer un gel d'agarose low melting d'ultérieures taille sélection de fin réparé ADN, voir ci-dessous).

Partie 2: Taille-sélection de l'ADN génomique par électrophorèse en champ pulsé (PFGE)

  1. Re-suspendre 1,5 g de basse température de fusion d'agarose dans 150 ml de TAE 1.0X courir tampon et ajouter une barre de mélanger de petites magnétique. Couvrir le ballon avec une pellicule de plastique au micro-ondes et faire bouillir rapidement dans le micro-ondes jusqu'à agarose est complètement dissous. Incorporer la solution jusqu'à ce qu'elle soit assez froide pour verser dans le plateau de gel (~ 60 ° C).
    Remarque: ne pas inclure le bromure d'éthidium ou SYBR Gold, soit dans le gel ou dans le tampon.
  2. Assembler le plateau de gel de jeter votre gel et choisissez un peigne qui vous donnera suffisamment d'espace pour charger la réparation complète de bout en un mélange de minerai de deux puits (80 ul, plus le montant approprié de tampon de chargement).
  3. Verser 2,2 L de 1.0X TAE dans la chambre d'électrophorèse et tourner sur la machine pour faire circuler le tampon en cours et configurez le dispositif de refroidissement à 14 ° C. La pompe doit fonctionner à 70 min pour assurer une circulation suffisante de la mémoire tampon de la course et garder le tampon à 14 ° C.
  4. Verser la fondue dans le bac d'agarose gel sur une surface bien nivelée une fois qu'il est refroidi et assurez-vous d'éviter les bulles. Veiller à la fondue d'agarose est encore sur le peigne de gel, sinon enlever le peigne et le remettre dans la fondue d'agarose. Une fois que le gel est solidifié, enlever le peigne et de la charge un médium que je PFG marqueur dans le quatrième puits du gel. Extruder agarose de la seringue de gel et émincez un petit bouchon de la fin avec un scalpel. Placez la fiche à l'avant du puits et sceller avec agarose fondu. Placer le gel dans la chambre d'électrophorèse.
    REMARQUE: Manipulez votre gel d'agarose très attentivement, car la fonte des gels de frein à faible facilement. Vérifiez si le tampon courant est refroidi à 14 ° C avant de commencer le chargement de votre gel. Si votre puits chercher bloqué par agarose, essayez l'époque qui suit immédiatement: avant de retirer le peigne à partir du gel, ajouter 1-2 ml TAE-tampon autour du peigne, ce qui se traduira par plus agréable puits.
  5. Dans le premier chargement ainsi 5 pl d'λ HindIII digérer suivie par 1 pi du marqueur de taille de contrôle fosmide (Epicentre, 100 ng / uL). Ajouter 10 ul d'eau stérile pour le marqueur de taille dans un microtube ainsi que d'une quantité appropriée de tampon de charge. Le plus grand volume, il est plus facile de charger le gel. Juste à côté du marqueur fosmide charger votre fin réparé et inactivés par la chaleur mélanger avec une quantité appropriée de tampon de chargement. Fermer le couvercle et programmer les paramètres.
    Note: nous recommandons vraiment de chargement des quantités différentes d'échelles autre ADN à environ quantifier la quantité d'ADN ou de visualiser l'étendue de la tonte de votre ADN génomique. Marqueurs de taille sont idéales λ ADN HindIII Digest et milieu de gamme, je PFG Marker (tous deux de l'ONE).
  6. Programme des paramètres: l'algorithme Auto utiliser si votre système est équipé d'ECP cela. Le programme calcule automatiquement le réglage dont vous avez besoin de séparer l'ADN d'une gamme de taille donnée. Paramètres utilisés sont: gamme de taille d'ADN 2-250 Kb; facteur d'étalonnage: 1; dégradé: [6 V / cm]; moment de l'exécution: 12:00 heures; angle inclus: 120 °, temps de commutation initiale: 0,1 sec; commutation dernière fois : 21.79 sec; facteur de montée en puissance linéaire =.
  7. Pour visualiser votre ADN, versez 250 ml de tampon TAE 1.0X dans un récipient et ajouter 25 ul de SYBR Or 10.000X; mélanger doucement avant de placer votre gel dans la solution. Tache votre gel pendant 1 h dans l'obscurité que SYBR Gold est sensible à la lumière.
    Remarque: gérer votre unegarose gel très attentivement que les gels de fusion bas de frein facilement.

Partie 3: ADN de récupération par extraction de gel et la ligature de l'ADN récupéré au vecteur de clonage fosmide

Tous les réactifs pour cette partie sont inclus dans le kit de production EPICENTRE fosmide-bibliothèque.

  1. Dans le même temps préparer un bain-marie à 70 ° C et une à 45 ° C pour l'étape de digestion sur gel.
  2. Prenez votre gel coloré avec une microtube taré vide et d'un scalpel stérile pour le transilluminateur lumière bleue. Visualisez votre fin réparé ADN génomique et le marqueur de contrôle fosmide taille. Accise une tranche de gel avec un scalpel qui ont migré avec et légèrement au-dessus de la position du marqueur de taille de contrôle fosmide (accises une tranche de gel qui est 5-7 mm de large) et le transfert de la tranche de la microtube taré. Exécuter un médium que je PFG Marker sur votre gel comme cela vous aide à ne pas couper le gel trop élevé.
    Remarque: poser une pellicule de plastique sur le transilluminateur lumière bleue avant de mettre votre gel sur elle pour empêcher la contamination croisée et porter les lunettes visualisation avant d'allumer la lumière bleue. Ne tranches de gel d'accise où l'ADN génomique est plus petit que le marqueur de taille de contrôle fosmide que cela se traduira indésirables clones chimériques.
    Vous pouvez couper et stocker des tranches de gel contenant plus ou moins élevés ADN de poids moléculaire pour la construction de shotgun du génome entier ou des bibliothèques d'alcoolémie, respectivement.
    I Stop: la tranche de gel récupéré (s) peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à un an
  3. Peser les tubes taré et de calculer le poids de la tranche de gel (s). 1 mg d'agarose donne environ 1 pi d'agarose fondu.
  4. Faire fondre le faible point de fusion d'agarose contenant votre ADN génomique dans un bain d'eau à 70 ° C pendant 10-15 minutes (nous n'ajoutons pas de tampon Gelase). Après votre tranche de gel soit complètement fondu, le transfert rapidement le tube à 45 ° C.
    Remarque: ne pas vortexer votre échantillon pour aider à dissoudre, car cela pourrait cisaillement votre ADN.
  5. Ajouter 1 U (1 microlitre) de préparation enzymatique Gelase par 100 ul d'agarose fondue. Incuber à 45 ° C pendant 1 heure puis ajouter plus de Gélase (2-4 pi) et incuber pendant une heure supplémentaire. Chauffer inactiver la préparation enzymatique Gélase à 70 ° C pendant 10 minutes.
    Placer le tube sur la glace pendant 10 min et centrifuger le tube à la vitesse maximale (13 000 tpm) pendant 15 min pour sédimenter les particules insolubles. Retirer délicatement le surnageant supérieur et de la transférer à un tube Falcon de 15 ml et ajouter 3 ml d'eau stérile dans le tube.
    Remarque: éviter le pipetage des granulés d'agarose. Comme nous ajoutons plus de Gélase inclus dans le kit, nous ordonnons de préparation supplémentaire Enzyme Gelase séparément.
  6. Transférer la solution dans une Amicon Ultra-4 Unité filtre centrifuge avec Ultracel-10 membranaire et tourner les tubes à 4000 g pendant 6-8 minutes et jeter le débit à travers. Centrifuger jusqu'à ce que la quantité de solution sur le filtre est réduite à environ 100 ~ 500 pl. Ajouter un autre 3 mL d'eau stérile pour le tube vide Falcon de dessus et de transférer la solution dans le tube Amicon et répétez l'étape de centrifugation. Lavez une troisième fois avec 3 ml d'eau et jetez traversent à nouveau. Réduire le volume final à 50 - 100 pi.
    Remarque: nous utilisons un rotor swing pour l'étape de centrifugation; suffit de placer le Amicon unité centrifuge filtre dans un tube Falcon de 50 ml pour le maintenir en place pendant la centrifugation. Amicon filtre retient toute sécurité 50 ul de solution sur le filtre même après centrifugation prolongée.
  7. Transférer la solution d'ADN reste du tube Amicon dans un pré-lavés Microcon YM-50 Unité centrifuge filtre et rincer le tube Amicon avec un supplément de 50 ul d'eau stérile pour récupérer tout l'ADN. Centrifuger les Microcon YM-50 Unité centrifuge filtre dans une microcentrifugeuse à 10.000 g jusqu'à ce que le filtre est toujours légèrement recouvert de liquide. Vérifiez à chaque minute si seulement une petite quantité de liquide est laissé sur le filtre. Retournez le filtre vers le bas et récupérer votre solution d'ADN par une étape de centrifugation seconde à 1000 g pendant 3 min dans un microtube frais. Le volume résultant ne doit pas dépasser 10 à 15 ul au total, sinon votre ADN pourrait être trop dilué dans l'étape de ligation.
    Remarque: veillez à ne pas tourner votre dispositif de filtre pour compléter la sécheresse. Si votre membrane est sèche, puis ajouter l'eau de 10 à 15 ul sur la membrane, agiter doucement pendant 30 secondes et récupérer votre ADN tel que décrit ci-dessus.
  8. Quantifier votre solution d'ADN résultant d'NanoDrop ou dosage PicoGreen.
  9. Réformé fin réparé ADN est maintenant prêt à être ligaturé au vecteur de clonage pCC1-fosmide. Décongelez la solution suivante sur la glace et assurez-vous que le vecteur d'insérer rapport molaire est de 10:1.
    Note: 0,5 pg pCC1-fosmide vecteur ~ 0,09 pmoles vecteur.
    0,25 pg d'ADN de ~ 40 Kb insert d'ADN insert ~ 0,009 pmoles
    Augmenter la quantité d'ADN utilisée dans l'étape de ligation peut être utile si vous devez obtenir seulement quelques clones fosmide après étalement infectés E. coli sur les cellulesplaques de sélection.

    Ajouter les réactifs dans l'ordre ci-dessous et centrifuger brièvement le tube pour obtenir tout le liquide vers le bas, appuyez sur le tube et le spin de nouveau:

    • x de l'eau stérile, ul
    • 1 pl de tampon 10X ligature rapide-Link
    • 1 pl 10 mM d'ATP
    • 1 pl pCC1-fosmide vecteur (0,5 pg / pl)
    • x ADN ul insérez concentré (0,25 pg)
    • Une ligase d'ADN rapide ul-Link
    • Volume de 10 ul de réaction total
  10. Incuber à température ambiante pendant 2 heures et la chaleur inactiver l'enzyme pendant 10 minutes à 70 ° C.
    Stop II: mélange de ligation conserver à -20 ° C ou passer à l'étape de conditionnement phage.
    Remarque: Une seule réaction de ligature va produire 10 3 -10 6 clones en fonction de la qualité de l'ADN de l'environnement. Basé sur l'estimation du nombre de clones qui est nécessaire pour une couverture particulière, vous pouvez étendre la réaction de ligature. Si la ligature est agrandie, alors la quantité d'extrait d'emballage phage devrait être renforcée en conséquence comme décrit ci-dessous.

Etape III

Partie 1: Phage-emballage du produit de ligation vecteur-insert

  1. Deux ou trois jours avant l'emballage destiné série de phages à condition EPI300-T1 souche R plaquage sur une plaque LB plaine et incuber pendant la nuit à 37 ° C pour obtenir des colonies isolées. Cette plaque peut être scellés et conservés à 4 ° C pour une utilisation future.
  2. La veille de la réaction de l'emballage inoculer 50 ml de bouillon LB + 10 mM MgSO 4 (ajouter 500 ul 1M MgSO 4) avec une seule colonie de la plaque généré à l'étape 1. Agiter à 225 rpm et 37 ° C la nuit.
  3. Le jour de l'emballage réactions inoculer frais bouillon LB 50 ml + 10 mM MgSO 4 à 5 mL de la culture de nuit préparé à l'étape 2. Croître à 37 ° C à une DO 600 de 0,8 à 1,0 et ne pas dépasser DO 600 de 1,0! Diluer l'échantillon avant la mesure sur le spectrophotomètre afin que vous obteniez un résultat précis. Stocker les piles sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à nouvel utilisé.
    Note: Arrêtez III: La culture peut être conservé à 4 ° C pendant 72 h si nécessaire, mais en utilisant une culture fraîche grandi est fortement recommandée.
  4. Dégel, sur la glace, les extraits MaxPlax Emballage Lambda, 1 tube pour chaque réaction de ligation effectués précédemment. Le dégel prendre 10-15 minutes. Pendant ce temps, placer 1,5 ml tube sur la glace pour être pré-refroidi.
    Remarque: ne laissez pas le phage décongelés sur la glace trop longtemps. Sinon efficacité d'infection phagique va baisser.
  5. Une fois décongelé immédiatement le transfert de 25 ul de chaque extrait d'emballage pour un second pré-réfrigérée 1,5 ml tube de centrifugeuse et le placer sur la glace. Retour d'extrait d'emballage restant à - 80 ° C.
    Remarque: ne pas conserver l'extrait d'emballage de la glace sèche ou de toute autre source 2 CO.
  6. Ajouter 10 ul de la réaction de ligature à chaque ul 25 des extraits décongelées sur glace. Mélanger à la pipette la solution plusieurs fois, éviter d'introduire des bulles d'air. Centrifuger brièvement les tubes pour obtenir tout le liquide au fond du tube et incuber les réactions de conditionnement à 30 ° C pendant 90 min. Après 80 min d'incubation de dégel reste d'extrait d'emballage sur la glace.
    Remarque: l'utilisation d'un bain d'eau plutôt que bloc de chauffage pour l'étape d'incubation à 30 ° C.
  7. Après 90 min de réaction emballage est complet ajouter le reste, soit 25 ul d'extrait d'emballage pour chaque tube de réaction. Réactions Incuber pendant 90 min supplémentaires à 30 ° C. Après 90 minutes d'incubation ajouter 100 ul du tampon de dilution du phage préparés dans chaque tube d'emballage et mélanger délicatement.
    Note: si votre efficacité devrait être faible à la fin, vos extraits phage pourrait être trop vieux ou qui ont été exposés à la glace sèche ou CO 2 d'autres sources. Dans notre expérience, l'emballage de phages à température ambiante (2 fois 90 min) au lieu de 30 ° C suivie d'une incubation finale supplémentaire pour 2 heures à 30 ° C a augmenté la quantité de clones en résultant.
  8. Ajouter 5 ul de chloroforme dans chaque tube et mélanger doucement résultant en un volume total de 165 ul dans le tube. Un précipité visqueux peuvent former après addition de chloroforme, ce ne sera pas interférer avec la production de la bibliothèque. Cependant éviter cette précipitation ainsi que la phase de chloroforme organiques lors du pipetage des particules de phages.
    Arrêtez IV: à ce point les particules de phages emballés peuvent être stockées pendant plusieurs jours à 4 ° C.
    Remarque: pour la meilleure efficacité d'infection phagique, l'utilisation de phages fraîchement conditionnée.

Partie 2: Infection de la bibliothèque de l'hôte E. coli

  1. Ajouter phages emballés pour EPI300-T1 cellules hôtes R (DO600 = 0,8-1,0) dans le rapport de 400 ul de cellules R EPI300-T1 pour chaque ul 10 des particules de phage. Pour éviter toute pipetage chloroforme nous utilisons 125 pl des particules de phages emballés et 5 mL de prêt EPI300-T1 cellules hôtes R. Mélanger doucement et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
    Remarque: attention de ne pas transférer le chloroforme pour les cellules hôtes lorsque vous retirez la particule de phage à partir du tube d'emballage phage. Si vous n'êtes pas sûr, prendre moins de particules de phages emballés.

Partie 3: Placage et titrage

  1. Ajouter 5-7 perles de verre stérilisés sur quatre petites LB + 12,5 pg / ml de chloramphénicol boîtes de Pétri.
  2. Fais deux fois 50 ul et deux fois 10 ul du phage infectés EPI300-T1 cellules R sur quatre assiettes séparées. Afin de garantir un étalement, ajouter un peu de bouillon LB (~ 50 pi) sur les plaques à l'ul 10 du phage cellules infectées. Agiter la plaque horizontale d'une répartition régulière sur les cellules sur la plaque. Laissez sécher la plaque pendant 15 min puis retirez les perles en inversant la plaque.
    Remarque: ces plaques sont utilisées pour déterminer le nombre de transformants et de calculer les dilutions appropriées nécessaires à l'étape la cueillette colonie afin d'éviter la densité des colonies trop élevé.
  3. Placez les assiettes à l'envers dans une étuve à 37 ° C pendant 16 à 24 heures jusqu'à 48 heures, jusqu'à former des colonies. Vérifiez les plaques après 24 heures afin de prévenir rapidement les clones de plus en plus de devenir des colonies voisin.
  4. En attendant, la récolte des cellules résiduelles gauche au cours de l'infection 5 ml par centrifugation à 3500 g pendant 10 minutes à 4 ° C. Jeter le surnageant. Ajouter 1 ml LB / 20% de glycérol dans le tube. Re-suspendre le culot cellulaire ul et qu'elle aliquote de 100 dans chacune des 2 ml tubes cryovial. Congeler immédiatement et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure dans la colonie la cueillette étape.
  5. Le lendemain, comptez le nombre de clones sur les plaques et déterminer le titre. Veillez à inclure le facteur de dilution correcte pour calculer le montant total des fosmide-clones.
    Remarque: cette procédure génère entre 10.000 et 50.000 fosmide-clones au total, mais en fonction de la qualité et la pureté de l'ADN extrait de l'environnement, une fourchette comprise entre 3000 à 80000 clones fosmide est observée.

Etape IV

Partie 1: Agar-et bien préparer les plaques

  1. Verser dans des assiettes des médias comme suit; comprennent 12,5 chloramphénicol ig par ml LB:
    • 100x15mm boîte de Petri: LB agar 25mL
    • 150X15mm boîte de Petri: 50ml LB agar
    • 245X245mm plaque carrée bioessai: LB agar 250mL
    Remarque: il est important de verser les médias sur une surface bien nivelée pour rendre la profondeur de la gélose uniformément sur la plaque. Nous vous recommandons d'utiliser des plaques 245X245 mm pour les bibliothèques fosmide donc vous n'avez pas à gérer de nombreuses plaques.
  2. Décongelez votre stock de glycérol contenant les clones préparés fosmide sur la glace. Passez le montant approprié pour la plaque que vous souhaitez utiliser en fonction de votre titre calculée (préparation du stock de glycérol se concentre de plus vos cellules ~ 5 fois). Le temps d'incubation pour la croissance cellulaire est de 24 heures à 37 ° C.
    Arrêtez V: quand colonies formées, de stocker des boîtes de gélose scellée à 4 ° C pendant un mois jusqu'à ce qu'ils soient utilisés dans l'étape colonie cueillette.
    Note: les colonies doivent être réparties équitablement, assez éloignés les uns des autres et devrait croître d'environ 1 mm de diamètre. Placage cellules en utilisant des perles de verre peut générer une bonne séparation entre les colonies. Sur un plat de Pétri 100x15mm, habituellement de 150 ~ 250 colonies sont une bonne densité pour une efficacité plus élevée du robot pour la cueillette et 22 x 22 cm, pas plus que 2000 des colonies doit être obtenu.
  3. Sur le jour de la cueillette colonie, préparer les 96 ou 384 plaques bien rempli avec du bouillon LB supplémenté avec 12,5 ug par le chloramphénicol mL de bouillon ainsi que 20% de glycérol pour le stockage de la bibliothèque à -80 ° C. Eh bien les plaques sont remplis avec le système de plaques automatisé QFill3 remplissage tel que décrit ci-dessous.
  4. Autoclave de 2 séries de bouteilles en verre (500 ml), les couvercles et les tubes de silicone. Ne pas manifold autoclave, y compris l'assemblage de seringues et bride de montage. Assemblez QFill3 près d'une flamme du brûleur Bunsen ou dans une hotte à créer et à maintenir un environnement stérile.
    Remarque: assurez-vous que le tuyau en silicone est inséré dans la vanne à pincement en appuyant sur la vanne à manchon activateur et glisser le tube fond de la valve. (Cela fonctionne comme un frein à la distribution moyen à la colonne suivante).
  5. Stériliser les aiguilles de distribution en passant par ~ 50 ml d'eau de Javel à 1%, autoclavés dH 2 O et 80% d'éthanol, un à la fois et placer un couvercle de boîte astuce sur la plate-forme pour recueillir les déchets des solutions. Après la stérilisation, le changement à l'autre ensemble composé de tubes de bouteille, couvercle et de silicium.
  6. Remplissez la bouteille avec un milieu de ~ 300 mL. Exécuter assez moyen par se débarrasser de tout l'éthanol restant de l'étape de nettoyage. Une fois que le tube est nettoyé, la charge d'une plaque 96/384 ainsi sur la plate-forme. Appuyez sur "Start" pour remplir votre assiette; chaque puits doit être rempli avec 200 pi de bouillon LB préparés. Pour nettoyer les aiguilles de distribution, exécutez ~ 50 ml d'éthanol à 80% grâce.
    Remarque: assurez-vous que votre plaque et est étiqueté avant le remplissage.

Partie 2: configuration du robot colonie picking

  1. Nous utilisons le clone du robot picking QPix2 acCording au manuel de l utilisateur. Les utilisateurs doivent être familiers de manipulation de leur robot et comment mettre en place tout pour garantir une efficacité plus élevée de cueillette.
  2. Pour créer un environnement stérile autour de la zone de picking clone, allumez la lumière UV pendant 30 minutes. Alors que la lumière UV est allumée, préparer 500 ml d'eau de Javel à 1%, 500 ml de solution stérile dH 2 O et 500 ml d'éthanol à 80%. Lorsque la lumière UV s'éteint remplir les plateaux en étiquetés. Versez toujours les solutions dans les bacs solution correctement étiquetés. De retour à l'avant de remplir l'eau de Javel à 1%, puis autoclavés dH 2 O et 80% d'éthanol dans le plateau avant. Assurez-vous qu'ils sont pleins. Cueillette des aiguilles ne peuvent pas être lavés correctement sans solution de lavage suffit.
    Remarque: l'éthanol de surveiller 80% au cours du temps. Il va s'évaporer et a besoin d'être rechargé.
  3. Après la mise en place des paramètres pour la cueillette optimale, placez les plaques de gélose préparée avec des clones et des plaques fosmide bien entre les postes dans le domaine de Q-Pix de travail. Assurez-vous que vous avez pris toutes les plaques couvre off!
  4. Les plaques doivent être serrés contre coin avant droit, donc il ne peut pas se déplacer pendant la cueillette. Ensuite, fermez le panneau avant.
    Note: Ceci est extrêmement important!
  5. Une fois tous les paramètres sont fixés à la procédure la cueillette peut commencer. Lorsque toutes cueillette est terminée rincer les pinceaux et des plateaux avec de l'eau déminéralisée et mis sur le banc à sécher. Nettoyer tout déversement qui pourrait avoir eu lieu, et essuyez l'intérieur de la Q-Pix avec de l'éthanol à 80%.

Partie 3: une nuit d'incubation et de stockage de la bibliothèque

  1. S'assurer que toutes les plaques des stocks de glycérol sont étiquetés, et les placer dans l'incubateur à 37 ° C pendant 24 heures. Laissez une note sur l'incubateur qui contient la date, le nombre de plaques incubées, le temps d'incubation, le temps pour l'enlèvement et vos initiales.
  2. Pour stockage de longue durée, mettre les incubations cultivées pendant une nuit dans un congélateur à -80 ° C.

Les résultats représentatifs:

Le protocole présenté décrit la procédure comment générer une bibliothèque de l'environnement fosmide pour capturer le contenu génétique d'une communauté microbienne dans un habitat donné. Ce protocole devrait créer une bibliothèque fosmide qui est représentatif du contenu génétique de l'environnement prélevés et devraient permettre au lecteur de modifier et d'optimiser les étapes cruciales si le montant de clones fosmide obtenu à la fin de toute la procédure est trop faible.

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Discussion

Une procédure est décrite la manière la plus efficace de générer une grande bibliothèque-insert fosmide avec l'ADN génomique provenant d'un échantillon des eaux côtières. En amont d'extraction d'ADN génomique est décrit dans un protocole séparé [3].

Comme la production fosmide-bibliothèque est un multi-processus, le plan d'au moins deux à trois semaines à temps pour toute la procédure, y compris toutes les étapes quatre présentées. L'extraction de l'ADN génomique est l'étape la plus cruciale et tous les flux bas-étapes reposent sur la qualité et la quantité d'ADN génomique extrait; donc envisager de passer assez de temps pour cette étape et travailler soigneusement. Qualité et contrôle de la quantité de votre ADN extrait est très important. Il peut arriver que le nombre de clones fosmide est faible, surtout si cela est la première bibliothèque que vous allez faire. Comme la construction de bibliothèques fosmide par lui-même est simple, l'échec est principalement causée par une qualité insuffisante et / ou la quantité de votre ADN génomique extrait et purifié. Pensez à ré-extraire l'ADN génomique et de prêter une attention particulière aux étapes de la purification de l'ADN et la récupération si votre construction de la bibliothèque n'a pas été couronnée de succès.

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Disclosures

Je n'ai rien à déclarer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. MT et SL ont été soutenus par des bourses de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution (cmde). MT a également reçu le soutien de la bourse de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

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References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

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