Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De overgrote meerderheid van micro-organismen in de natuur op dit moment ontoegankelijk blijven voor de traditionele teeltmethoden. In het afgelopen decennium, de cultuur-onafhankelijke milieu-genoom (

Protocol

Fosmid bibliotheek bouw is verdeeld in vier belangrijkste stappen en onderverdeeld in verschillende delen (zie figuur 1 voor een overzicht).

Stap I (zie protocol "DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex filters" [3])

Deel 1: Enzyme-gekatalyseerde cel lysis

Deel 2: Zuivering van milieu-DNA door CsCl dichtheidsgradiënt centrifugeren en DNA herstel

Deel 3: Kwaliteitscontrole van geëxtraheerde DNA door gelelektroforese

Stap II

Deel 1: enzymatische modificatie stappen van teruggewonnen milieu-DNA

Alle reagentia die nodig zijn voor de eind-reparatie stap van de milieu-DNA is opgenomen in de pCC1 Fosmid Library Production Kit van EPICENTRUM. Idealiter zou je genomisch DNA worden aangepast aan de 0,5 pg / pl.

  1. Dooi alle reagentia op het ijs, combineren de volgende en kort centrifugeer de buis om alle vloeistof op de bodem:
    • x pi steriel water
    • 8 ul 10X end-reparatie buffer
    • 8 ul 2,5 mM dNTP mix
    • 8 ul 10 mM ATP
    • tot en met 20 pg geschoren insert DNA (~ 0,5 pg / pl)
    • 4 il end-reparatie-enzym mix
    • 80 ui totaal volume reactie
  2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een minimale tijd van 45 minuten tot 60 minuten en warmte inactiveren van het enzym mix bij 70 ° C gedurende 10 minuten (in de tussentijd, een laagsmeltende agarosegel voor te bereiden op de volgende grootte-selectie van end-gerepareerd DNA, zie hieronder).

Deel 2: Grootte-selectie van genomisch DNA door pulsed-field gel elektroforese (PFGE)

  1. Re-schorten 1,5 g laagsmeltende agarose in 150 ml 1,0 TAE buffer draaien en voeg een kleine magnetische roerstaaf. Dek de kolf met microwavable plasticfolie en kook al snel in de magnetron totdat agarose volledig is opgelost. Roer oplossing totdat het koud genoeg om te gieten in de gel lade (~ 60 ° C).
    Let op: niet onder ethidiumbromide of SYBR Gold hetzij in de gel of in de running buffer.
  2. Monteer de gel lade om uw gel gegoten en een kam die geeft je voldoende ruimte om de complete end-reparatie mix te laden in een of twee putten (80 pl plus juiste hoeveelheid laadbuffer) te kiezen.
  3. Giet 2,2 L van 1,0 TAE in de electroforese kamer en zet de machine aan de lopende buffer circuleren en zet de koeling tot 14 ° C. De pomp moet draaien op 70 toeren per minuut om voldoende circulatie van de lopende buffer te waarborgen en te houden van de buffer bij 14 ° C.
  4. Giet de gesmolten agarose gel in de lade op een waterpas oppervlak als het eenmaal is afgekoeld en zorg ervoor dat je vermijden bubbels. Zorg ervoor dat de gesmolten agarose is zelfs op de gel kam, anders verwijderen van de kam en zet het terug in de gesmolten agarose. Nadat de gel is gestold, verwijder de kam en de belasting een midrange ik PFG marker in de vierde goed van de gel. Extrude agarose uit de gel spuit en plak een kleine stekker van het einde met een scalpel. Plaats de stekker aan de voorkant van de put en afdichting met gesmolten agarose. Plaats de gel in de elektroforese kamer.
    Opmerking: Behandel uw agarose gel zeer zorgvuldig zo laag smeltende gels rem gemakkelijk. Controleer of de lopende buffer is afgekoeld tot 14 ° C voordat u start met het laden van uw gel. Als je bronnen kijken geblokkeerd door agarose, probeer dan het volgende volgende keer: voordat je de kam te verwijderen uit de gel, 1-2 ml TAE-buffer toe te voegen rond de kam, dit zal resulteren in mooiere putten.
  5. In de eerste put belasting 5 pi van λ HindIII verteren, gevolgd door een pi van de fosmid controle grootte marker (EPICENTRUM, 100 ng / ul). Voeg 10 pi steriel water tot de grootte marker in een microcentrifugebuis evenals een passende hoeveelheid van laad-buffer. Het grotere volume maakt het makkelijker het laden van de gel. Direct naast het fosmid marker load uw end-repareren en hitte-geïnactiveerd mengen met een geschikte hoeveelheid laadbuffer. Sluit het deksel en het programma de instellingen.
    Let op: wij echt aanraden het laden van verschillende hoeveelheden van andere DNA ladders tot ongeveer kwantificeren van de hoeveelheid DNA of om de mate van afschuiving van uw genomisch DNA te visualiseren. Ideale grootte markers zijn λ DNA-Hindlll Digest-en midrange-I PFG Marker (zowel vanuit NEB).
  6. Programmeer de instellingen: gebruik Auto algoritme als uw PFGE-systeem is uitgerust met deze. Het programma berekent automatisch de instelling die u nodig hebt om DNA scheiden van een bepaalde grootte. Gebruikte instellingen zijn: DNA grootte variëren 2-250 Kb; kalibratiefactor: 1; gradiënt: [6 V / cm]; run time: 12:00 uur; ingesloten hoek: 120 °; eerste schakeltijd: 0,1 sec; laatste schakeltijd : 21.79 sec; speedramp factor a = lineair.
  7. Om dit te visualiseren je DNA, giet 250 ml 1,0 TAE buffer in een container en voeg 25 ul van 10.000x SYBR Gold; meng voorzichtig voordat u uw gel plaatsen in de oplossing. Vlekken op uw gel gedurende 1 uur in het donker als SYBR Goud is gevoelig voor licht.
    Let op: omgaan met uw eengarose gel zeer zorgvuldig zo laag smeltende gels rem gemakkelijk.

Deel 3: DNA-herstel door gel extractie en ligatie van DNA hersteld om de fosmid kloneringsvector

Alle reagentia voor dit deel zijn opgenomen in de EPICENTRUM fosmid-bibliotheek productie van kit.

  1. In de tussentijd bereiden op een waterbad bij 70 ° C en een op 45 ° C voor de gel spijsvertering stap.
  2. Nemen samen uw gekleurde gel met een lege getarreerd microcentrifugebuis en een steriel scalpel met het blauwe licht transilluminator. Visualiseer uw end-gerepareerd genomisch DNA en de fosmid controle grootte marker. Accijnzen een gel plak met een scalpel die gemigreerd met en iets boven de positie van de fosmid controle grootte marker (accijnzen een gel plak, die is 5-7 mm breed) en breng de plak aan de getareerde microcentrifugebuis. Voer een midrange ik PFG marker op uw gel, omdat dit helpt u bij het niet knippen van de gel te hoog.
    Let op: leg plasticfolie op het blauwe licht transilluminator voordat je je gel op om kruisbesmetting te voorkomen en het bekijken van bril te dragen voordat u het blauwe licht. Geen accijnzen gel plakken waar het genomische DNA is kleiner dan de fosmid controle grootte marker, omdat dit zal resulteren in ongewenste chimerisch klonen.
    U kunt knippen en opslaan gel plakjes met een lager of hoger moleculair gewicht DNA voor het maken van hele genoom shotgun of BAC bibliotheken, respectievelijk.
    Stop I: de teruggewonnen gel slice (s) kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot een jaar
  3. Weeg de getarreerd buizen en bereken het gewicht van de gel slice (s). 1 mg agarose levert ongeveer 1 ul van gesmolten agarose.
  4. Smelt de lage smeltpunt agarose met uw genomische DNA in een waterbad bij 70 ° C gedurende 10-15 minuten (we voegen geen gelase buffer). Na uw gel slice volledig gesmolten is, snel overdracht van de buis tot 45 ° C.
    Let op: niet vortex uw monster te helpen oplossen, omdat dit zou kunnen afschuiving je DNA.
  5. Voeg een U (1μl) van GELase enzympreparaat per 100 ul van gesmolten agarose. Incubeer bij 45 ° C gedurende 1 uur en voeg dan meer GELase (2-4 pl) en incubeer gedurende een extra uur. Warmte inactiveren van de GELase enzympreparaat bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
    Plaats de buis op ijs gedurende 10 minuten en centrifugeer de buis op maximale snelheid (13000 rpm) gedurende 15 minuten tot een pellet onoplosbare deeltjes. Verwijder voorzichtig de bovenste supernatant en overbrengen naar een 15 ml Falcon buis en voeg 3 ml steriel water om de buis.
    Let op: vermijd pipetteren elke gepelleteerd agarose. Omdat wij meer GELase dan inbegrepen in de kit, bestellen we extra GELase enzympreparaat afzonderlijk.
  6. Breng de oplossing om een ​​Amicon Ultra-4 Centrifugaal Filter Unit met Ultracel-10 membraan en draai de buis bij 4.000 g gedurende 6-8 minuten en gooi de doorstromen. Centrifugeer totdat het bedrag van de oplossing op het filter wordt teruggebracht tot ongeveer 100 ~ 500 pi. Voeg nog een 3 ml steriel water om de lege Falcon buis van boven en breng de oplossing voor de Amicon buis en herhaal de centrifugatie stap. Was een derde keer met 3 ml water en gooi stromen weer. Verminder het uiteindelijke volume tot ongeveer 50 - 100 pl.
    Let op: we gebruiken een swingende emmer rotor voor de centrifuge stap, gewoon de Amicon centrifugaalfilter apparaat in een 50 ml Falcon buis te zijn plaats te houden tijdens het centrifugeren. Amicon filter houdt veilig 50 ul van de oplossing op het filter, zelfs na uitgebreid centrifugeren.
  7. Breng de resterende DNA-oplossing uit de Amicon buis in een pre-gewassen Microcon YM-50 centrifugaalfilter Unit en spoel de Amicon buis met een extra 50 pi steriel water om alle DNA te herstellen. Centrifugeer de Microcon YM-50 Centrifugaal Filter Unit in een microcentrifuge bij 10.000 g totdat het filter is nog enigszins bedekt met vloeistof. Controleer elke minuut al was het maar een kleine hoeveelheid vloeistof op het filter. Draai het filter op zijn kop en herstellen van uw DNA-oplossing door een tweede centrifugatie stap bij 1.000 g gedurende 3 minuten in een frisse microcentrifugebuis. Het resulterende volume mag niet groter zijn dan 10-15 ui in totaal, anders wordt je DNA kan ook worden verdund in de ligatie stap.
    Let op: wees niet te uw filter het apparaat draaien tot droog te voltooien. Als je membraan droog is, voeg dan 10-15 ul water op het membraan, schud zachtjes gedurende 30 seconden en herstellen van uw DNA zoals hierboven beschreven.
  8. Kwantificeren de resulterende DNA-oplossing door NanoDrop of PicoGreen test.
  9. Herstelde end-DNA gerepareerd is nu klaar om te worden geligeerd aan de pCC1-fosmid kloneringsvector. Ontdooi de volgende oplossing op ijs en zorg ervoor dat de vector om molaire verhouding insert is 10:01.
    Let op: 0,5 ug pCC1-fosmid vector ~ 0,09 pmol vector.
    0,25 ug van ~ 40 Kb insert DNA ~ 0,009 pmol insert DNA
    Het verhogen van de hoeveelheid DNA die in de ligatie stap kan nuttig zijn als u het verkrijgen van slechts een paar fosmid klonen na plating besmet E. coli-cellen opselectie van platen.

    Voeg de reagentia in de volgorde hieronder en kort centrifugeer de buis om alle vloeistof op de bodem, tikt u op de buis en draai weer:

    • x pi steriel water
    • 1 ul 10X Fast-Link ligatiebuffer
    • 1 ui 10 mM ATP
    • 1 pi pCC1-fosmid vector (0,5 pg / pl)
    • x ul geconcentreerd insert DNA (0,25 pg)
    • 1 pi Fast-Link DNA ligase
    • 10 ul totale reactietijd volume
  10. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en warmte inactiveren van het enzym gedurende 10 minuten bij 70 ° C.
    Stop II: bewaren ligatiemengsel bij -20 ° C of gaan naar de faag verpakking stap.
    Opmerking: Een enkele ligatiereactie zal produceren 10 3 -10 6 klonen afhankelijk van de kwaliteit van de milieu-DNA. Op basis van het geschatte aantal klonen dat nodig is voor bepaalde dekking, kunt u opschalen de ligatie reactie. Als de ligatie wordt opgeschaald, wordt het bedrag van de verpakkingen faag-extract moet worden opgeschaald dienovereenkomstig zoals hieronder beschreven.

Stap III

Deel 1: Faag-verpakking van vector-insert ligatieproduct

  1. Twee of drie dagen voor de beoogde faag verpakking streak uit EPI300-T1 R plating belasting die op een gewone LB plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C om enkele kolonies te krijgen. Deze plaat kan worden verzegeld en bewaard bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
  2. De dag voor de verpakking reactie enten 50 ml van LB bouillon + 10 mM MgSO 4 (voeg 500 pi 1M MgSO 4) met een enkele kolonie van de plaat gegenereerd in stap 1. Schudden bij 225 tpm en 37 ° C gedurende de nacht.
  3. De dag van de verpakking reacties enten verse 50 ml LB-bouillon + 10 mM MgSO 4 met 5 ml van de nacht cultuur bereid in stap 2. Groeien bij 37 ° C tot een OD 600 van 0,8 tot 1,0 en niet hoger zijn dan 600 OD van 1,0! Verdunnen uw monster voor de meting van de spectrofotometer, zodat je een nauwkeurig resultaat. Bewaar de cellen op ijs of bij 4 ° C tot verder gebruikt.
    Let op: Stop III: cultuur kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 72 uur, indien nodig, maar met behulp van een verse volwassen cultuur wordt sterk aanbevolen.
  4. Dooi, op ijs, de MaxPlax Lambda Verpakkingen Extracten, 1 tube voor elke ligatiereactie uitgevoerd eerder. Ontdooien duurt 10-15 minuten. Ondertussen, plaats 1,5 mL buis op ijs te pre-gekoeld.
    Let op: niet laten ontdooien faag op het ijs te lang. Anders faag infectie-efficiëntie zal dalen.
  5. Eenmaal ontdooid onmiddellijk overdracht 25 ul van elke verpakking uit te pakken naar een tweede pre-gekoelde 1,5 mL microfugebuisje en leg ze op ijs. Keer terug resterende verpakking uit te pakken naar - 80 ° C.
    Let op: niet slaan de verpakking extract met droog ijs of een andere CO 2-bron.
  6. Voeg 10 ul van de ligatie reactie op elke 25 ul van de ontdooide extracten op het ijs. Meng door pipetteren de oplossing meerdere malen voorkomen dat er luchtbellen. Kort centrifuge de buizen om alle vloeistof tot op de bodem van de buis en de verpakking reacties incubeer bij 30 ° C gedurende 90 minuten. Na 80 min incubatie dooi de resterende verpakking halen op het ijs.
    Opmerking: Gebruik een waterbad in plaats van verwarmen blok voor de 30 ° C incubatie stap.
  7. Na 90 min verpakking reactie is voltooid voeg de resterende 25 ul van verpakkingen extract om elke reactie buis. Incubeer reacties voor extra 90 minuten bij 30 ° C. Na 90 min incubatie voeg 100 ul van de voorbereide faag verdunningsbuffer in elke verpakking buis en meng voorzichtig.
    Let op: als uw efficiëntie te laag zijn aan het einde, je faag haalt misschien te oud of zijn blootgesteld aan droog ijs of een andere CO 2-bron. In onze ervaring, faag verpakking bij kamertemperatuur (2 keer 90 min) in plaats van 30 ° C, gevolgd door een laatste extra incubatie gedurende 2 uur bij 30 ° C verhoogd de hoeveelheid van de resulterende klonen.
  8. Voeg 5 ul van chloroform aan elke buis en meng voorzichtig wat resulteert in een totaal volume van 165 ul in de buis. Een viskeuze neerslag kan ontstaan ​​na chloroform Daarnaast, dit zal niet interfereren met de productie bibliotheek. Echter voorkomen dat deze neerslag, alsook de organische chloroform fase waarin pipetteren de faag partikels.
    Stop IV: op dit punt de verpakte faag partikels kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen bij 4 ° C.
    Let op: voor de beste faag infectie-efficiëntie, gebruik van vers verpakte faag.

Deel 2: Infectie van de bibliotheek gastheer E. coli

  1. Voeg verpakt faag aan EPI300-T1 R gastheercellen (OD 600 = 0,8 tot 1.0) in de verhouding van 400 ul van EPI300-T1 R cellen voor elke 10 ul van faag deeltjes. Om te voorkomen dat pipetteren elk chloroform we gebruik van 125 ul van de verpakte faag deeltjes en 5 ml van de bereide EPI300-T1 R gastheercellen. Meng voorzichtig en vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    Let op: wees niet te chloroform over te dragen aan de gastheercellen wanneer u de faag deeltje uit de faag verpakking buis. Als u twijfelt, neem dan minder van de verpakte faag deeltjes.

Deel 3: Plating en titering

  1. Voeg 5-7 gesteriliseerd glazen kralen op vier kleine LB + 12,5 ng / ml chlooramfenicol petrischaaltjes.
  2. Spreid twee keer 50 ui en twee keer 10 ul van de faag geïnfecteerde EPI300-T1 R cellen op vier afzonderlijke platen. Om te zorgen voor een gelijkmatige spreiding, voeg wat LB bouillon (~ 50 ul) om de platen met de 10 ul van faag geïnfecteerde cellen. Schud de plaat horizontaal gelijkmatig verspreid de cellen op het bord. Laat de plaat drogen gedurende 15 minuten en verwijder vervolgens de kralen door het omkeren van de plaat.
    Let op: deze platen worden gebruikt om het aantal transformanten te bepalen en de geschikte verdunningen nodig in de kolonie plukken stap naar een te hoge dichtheid kolonie te voorkomen dat te berekenen.
  3. Plaats de platen ondersteboven in een 37 ° C incubator 16 tot 24 uur tot 48 uur tot kolonies te vormen. Controleer platen na 24 uur te snel groeiende klonen te voorkomen uit te groeien tot buurman kolonies.
  4. Ondertussen oogst van de resterende cellen links-over van de 5 mL infectie door centrifugeren bij 3500 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatans af. Voeg 1 mL LB / 20% glycerol aan de buis. Resuspendeer de celpellet en hoeveelheid aan 100 pi elk in 2 mL cryovial buizen. Freeze onmiddellijk en bewaar bij -80 ° C voor verder gebruik in de kolonie plukken stap.
  5. De volgende dag, tel het aantal klonen op de borden en bepaal de titer. Zorg ervoor dat u de juiste verdunningsfactor omvatten om het totale bedrag van de fosmid-klonen te berekenen.
    Opmerking: Deze procedure genereert tussen de 10.000 en 50.000 fosmid-klonen in totaal, maar afhankelijk van de kwaliteit en zuiverheid van het geëxtraheerde DNA milieu, een bereik tussen 3.000 tot 80.000 fosmid klonen wordt waargenomen.

Stap IV

Deel 1: Agar-en goed platen voorbereiding

  1. Giet media in platen als volgt; onder meer 12,5 microgram per ml chlooramfenicol LB:
    • 100X15mm petrischaal: 25ml LB-agar
    • 150X15mm petrischaal: 50ml LB-agar
    • 245X245mm vierkante bioassay plaat: 250mL LB-agar
    Let op: het is belangrijk om de media op een waterpas oppervlak gieten tot een diepte van agar gelijkmatig te maken over de plaat. Wij raden u aan 245X245 mm platen voor fosmid bibliotheken, zodat u niet hoeft te veel platen af ​​te handelen.
  2. Ontdooi je glycerol voorraad met de bereide fosmid klonen op ijs. Verdeel het bedrag dat geschikt is voor de plaat die u wilt gebruiken op basis van uw berekende titer (de voorbereiding van de glycerol voorraad bovendien concentreert je cellen ~ 5 maal). Incubatietijd voor celgroei is 24 uur bij 37 ° C.
    Stop V: wanneer kolonies gevormd, verzegeld agar platen bewaren bij 4 ° C gedurende een maand totdat ze worden gebruikt in de kolonie plukken stap.
    Let op: kolonies moeten worden verspreid gelijkmatig, ver genoeg van elkaar en moeten ongeveer 1 mm groeien in diameter. Plating cellen door gebruik te maken glazen kralen kunnen leiden tot een goede scheiding tussen de kolonies. Op een 100X15mm petrischaal, meestal 150 ~ 250 kolonies zijn een goede dichtheid voor de hoogste robot picking efficiëntie en voor 22 x 22 cm, mag niet meer dan 2.000 kolonies worden verkregen.
  3. Op de dag van de kolonie plukken, bereiden 96 of 384 putjes gevuld met LB-bouillon aangevuld met 12,5 mg chlooramfenicol per ml bouillon en 20% glycerol voor bibliotheek opslag bij -80 ° C. Well platen worden gevuld met de geautomatiseerde QFill3 plaat vulsysteem zoals hieronder beschreven.
  4. Autoclaaf twee sets van glazen flessen (500 ml), deksels en silicone. Geen autoclaaf spruitstuk, inclusief naald montage en montageflens. Monteer QFill3 de buurt van een bunsenbrander vlam of binnen een kap te creëren en behouden van een steriele omgeving.
    Let op: zorg ervoor dat de siliconen slang ingebracht in de knijpklep door op de knijpklep activator en schuif de slang volledig in het ventiel. (Dit werkt als een rem voor het afgeven van medium naar de volgende kolom).
  5. Steriliseren doseernaalden door het passeren door de ~ 50 ml van 1% bleekmiddel, geautoclaveerd dH 2 O en 80% ethanol, een voor een tijd en plaats een tip deksel op het platform om afval oplossingen te verzamelen. Na sterilisatie, naar de andere set bestaande uit fles, deksel en silicium buizen.
  6. Vul de fles met ~ 300 ml medium. Ren genoeg medium om zich te ontdoen van de resterende ethanol dat bij de reiniging stap. Zodra de slang wordt schoongemaakt, plaatst u een 96/384 wells plaat op het platform. Druk op "start" op te vullen je bord, elk putje moet worden gevuld met 200 ul van bereid LB bouillon. Voor het reinigen van doseernaalden, run ~ 50 ml 80% ethanol door.
    Let op: zorg ervoor dat je goed bord is gelabeld voor het vullen.

Deel 2: kolonie picking robot setup

  1. Wij maken gebruik van de kloon picking robot QPix2 acgens de handleiding s. Gebruikers moeten vertrouwd zijn omgaan met hun robot en hoe u alles aan de hoogste plukken rendement te garanderen.
  2. Voor het maken van een steriele omgeving rond de kloon picking gebied, zet de UV-licht gedurende 30 minuten. Terwijl het UV-licht aan is, voor te bereiden 500 ml van 1% bleekmiddel, 500 ml steriele dH 2 O en 500 ml 80% ethanol. Wanneer het UV-licht wordt uitgeschakeld vullen de bakken als geëtiketteerd. Altijd giet de oplossingen in het correct geëtiketteerd oplossing laden. Van achter naar voor in te vullen 1% bleekmiddel, vervolgens geautoclaveerd dH 2 O en 80% ethanol in de voorste lade. Zorg ervoor dat ze vol zijn. Plukken naalden kunnen niet goed worden gewassen zonder voldoende wassen oplossing.
    Let op: monitor 80% ethanol in de tijd. Het zal verdampen en moet worden bijgevuld.
  3. Na het instellen van de parameters voor een optimale picking, plaats de voorbereide agarplaten met fosmid klonen en goed platen tussen de palen in de Q-Pix werkgebied. Zorg ervoor dat u alles hebt gedaan wat plaat dekt af!
  4. De platen moeten worden strak tegen front rechterbovenhoek, zodat het niet kan bewegen tijdens het plukken. Sluit vervolgens het voorpaneel.
    Let op: Dit is uiterst belangrijk!
  5. Nadat alle parameters zijn ingesteld het plukken procedure kan beginnen. Als alle picking is voltooid Spoel de borstels en trays met gedeïoniseerd water en zet op de bank om te drogen. Gemorst die hebben plaatsgevonden, en veeg de binnenkant van de Q-Pix met 80% ethanol.

Deel 3: Overnachting incubatie en bibliotheek opslag

  1. Zorg ervoor dat alle glycerol voorraad platen label, en plaats ze in de 37 ° C incubator gedurende 24 uur. Laat een toelichting op de incubator dat de datum, het aantal platen geïncubeerd, de tijd van de incubatietijd, de tijd voor het verwijderen en uw initialen bevat.
  2. Voor lange tijd bewaren, zet het uitgegroeid tot een 's nachts incubaties -80 ° C vriezer.

Representatieve resultaten:

De gepresenteerde protocol beschrijft de procedure hoe een milieu fosmid bibliotheek naar de genetische inhoud van een microbiële gemeenschap vast te leggen in een bepaald leefgebied genereren. Dit protocol zou moeten leiden tot een fosmid bibliotheek die representatief is voor de genetische inhoud van de bemonsterde milieu en in staat moet stellen de lezer aan te passen en te optimaliseren kritische stappen indien het bedrag van fosmid klonen verkregen op het einde van de hele procedure is te laag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een procedure wordt beschreven hoe u de meest efficiënte wijze een grote insert fosmid bibliotheek met genomisch DNA afgeleid uit een kust watermonster te genereren. Up-stream genomisch DNA-extractie wordt beschreven in een apart protocol [3].

Omdat de fosmid-bibliotheek is een productie van meerstaps-proces, plan minstens twee tot drie weken op tijd voor de hele procedure, inclusief alle vier gepresenteerde stappen. De winning van genomisch DNA is de meest cruciale stappen en alle down-stream treden vertrouwen op de kwaliteit en kwantiteit van de afgezogen genomisch DNA, dus overweeg besteden genoeg tijd voor deze stap en werk zorgvuldig. Kwaliteit en kwantiteit controle van uw geëxtraheerde DNA is erg belangrijk. Het kan gebeuren dat het aantal fosmid klonen laag is vooral als dit is de eerste bibliotheek die u gaat maken. Omdat de bouw door fosmid bibliotheek zelf is recht naar voren, is het niet voornamelijk veroorzaakt door onvoldoende kwaliteit en / of kwantiteit van uw geëxtraheerd en gezuiverd genomisch DNA. Overwegen om opnieuw uit te pakken genomisch DNA en speciale aandacht te besteden aan de stappen die betrokken zijn bij zuivering en DNA-herstel als uw bibliotheek constructie was niet succesvol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ik heb niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio's van kust-en open water van de oceaan. MT en SL werden ondersteund door beurzen uit het TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE). MT kreeg ook fellowship steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics