Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

Biology

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Summary

Costruzione di una biblioteca con fosmid ambientale DNA genomico isolato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia è descritto. La biblioteca clone risultante è raccolto in 384 pozzetti e archiviati per il sequenziamento a valle e screening funzionale con l'applicazione di un sistema automatizzato di raccolta colonia.

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Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

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Abstract

La stragrande maggioranza dei microbi in natura attualmente rimangono inaccessibili ai metodi di coltivazione tradizionali. Negli ultimi dieci anni, la cultura indipendente genomica ambientale (

Protocol

Costruzione della libreria Fosmid è stato suddiviso in quattro fasi principali e suddivisi in più parti (vedi Fig.1 per una panoramica).

Fase I (vedi protocollo di "estrazione del DNA da 0,22 mM filtri Sterivex" [3])

Parte 1: catalizzate da enzimi lisi cellulare

Parte 2: La purificazione del DNA ambientale per centrifugazione CsCl gradiente di densità e di recupero del DNA

Parte 3: Controllo di qualità del DNA estratto mediante elettroforesi su gel

Fase II

Parte 1: passi la modificazione enzimatica della DNA recuperato ambientale

Tutti i reagenti necessari per la riparazione di fine tappa del DNA ambientale sono inclusi nel kit pCC1 Produzione Biblioteca Fosmid da Epicentre. Idealmente, il vostro DNA genomico deve essere regolato a 0,5 mg / mL.

  1. Scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio, unire la seguente e brevemente centrifugare la provetta per ottenere tutto il liquido sul fondo:
    • x microlitri di acqua sterile
    • 8 microlitri 10X end-riparazione tampone
    • 8 microlitri 2,5 mM dNTP mix
    • 8 microlitri 10 mM ATP
    • fino a 20 mcg tranciato di DNA (~ 0.5 mg / mL)
    • 4 microlitri di fine riparazione enzima mix
    • 80 microlitri di volume di reazione totale
  2. Incubare a temperatura ambiente per un tempo minimo di 45 minuti fino a 60 minuti e calore inattivare il mix enzima a 70 ° C per 10 minuti (nel frattempo, preparare un basso punto di fusione gel per la successiva dimensione-selezione di fine riparato DNA, vedi sotto).

Parte 2: Dimensione-selezione di DNA genomico da campo pulsato elettroforesi su gel (PFGE)

  1. Risospendere 1,5 g di bassa fusione agarosio in 150 ml di TAE 1.0X corsa tampone e aggiungere un piccolo bar ancoretta magnetica. Coprire il recipiente con microwavable pellicola trasparente e fate bollire rapidamente nel forno a microonde fino agarosio è completamente sciolto. Mescolare la soluzione fino a quando non è abbastanza freddo per versare nel vassoio del gel (~ 60 ° C).
    Nota: non comprendono bromuro di etidio o Gold SYBR sia in gel o in tampone di corsa.
  2. Montare il vassoio del gel per lanciare i vostri gel e scegliere un pettine che vi darà spazio sufficiente per caricare la soluzione end-riparazione mix in uno o due pozzi (80 microlitri quantità più adeguato di tampone di carico).
  3. Versate 2,2 L di 1,0 X TAE nella camera di elettroforesi e accendere la macchina per far circolare il tampone di corsa e impostare il dispositivo di raffreddamento a 14 ° C. La pompa dovrebbe funzionare a 70 giri per garantire la circolazione sufficiente di tampone di corsa e tenere il buffer a 14 ° C.
  4. Versare il fuso agarosio nel cassetto gel su una superficie ben livellata una volta che è raffreddato e fare in modo di evitare bolle. Assicurarsi che il fuso agarosio è anche sul pettine gel, altrimenti rimuovere il pettine e rimetterlo nel fuso agarosio. Una volta che il gel è solidificato, rimuovere il pettine e carico di un midrange ho PFG marcatore nel pozzo quarto del gel. Estrudere agarosio dalla siringa gel e una spina piccola fetta dalla fine con un bisturi. Posizionare la spina nella parte anteriore del pozzo e sigillare con fuso agarosio. Mettere il gel nella camera di elettroforesi.
    Nota: gestire i gel di agarosio con molta attenzione come freno a basso gel fusione facilmente. Controllare se il tampone di corsa si è raffreddato a 14 ° C prima di iniziare il caricamento del gel. Se il vostro sguardo pozzi bloccato da agarosio, provare i seguenti orari successiva: prima di rimuovere il pettine dal gel, aggiungere 1-2 mL di TAE-tampone intorno al pettine: questo si tradurrà in più bello pozzi.
  5. Nel primo pozzo di carico 5 ml di λ HindIII digerire seguita da 1 ml del marcatore fosmid dimensioni di controllo (Epicentre, 100 ng / mL). Aggiungere 10 ml di acqua sterile per il marcatore dimensioni in una provetta e una quantità appropriata di tampone di caricamento. Il volume maggiore rende più facile per caricare il gel. Direttamente accanto al marcatore fosmid caricare il finale riparato e inattivato al calore mescolare con una quantità appropriata di tampone di caricamento. Chiudere il coperchio e programmare le impostazioni.
    Nota: abbiamo veramente consigliamo di carico diverse quantità di DNA di altre scale per quantificare approssimativamente la quantità di DNA o di visualizzare l'estensione del taglio del DNA genomico. Marcatori dimensione ideale sono λ DNA HindIII Digest e midrange I PFG Marker (sia dal NEB).
  6. Programmare le impostazioni: Auto algoritmo utilizzare se il vostro sistema PFGE è dotato di questa. Il programma calcola automaticamente l'impostazione che si necessità di separare DNA di un dato intervallo di grandezza. Impostazioni utilizzate sono: dimensioni del DNA gamma 2-250 Kb; fattore di calibrazione: 1; gradiente: [6 V / cm]; fase di esecuzione: 12:00; angolo incluso: 120 °, tempo di commutazione iniziale: 0,1 sec; di commutazione finale di tempo : 21,79 sec; fattore rampa lineare =.
  7. Per visualizzare il vostro DNA, versare 250 ml di tampone TAE 1.0X in un recipiente e aggiungere 25 ml di 10.000X Oro SYBR; mescolare delicatamente prima di inserire il vostro gel nella soluzione. Macchiare il gel per 1 ora al buio, come SYBR oro è sensibile alla luce.
    Nota: gestire il tuo unogarose gel molto attentamente come gel bassa temperatura di fusione del freno facilmente.

Parte 3: DNA-recupero per estrazione gel e legatura di DNA recuperato al vettore di clonazione fosmid

Tutti i reagenti per questa parte sono inclusi nel kit fosmid-biblioteca produzione Epicentre.

  1. Nel frattempo preparare un bagno d'acqua a 70 ° C e uno a 45 ° C per la fase di digestione del gel.
  2. Prendete il vostro gel colorato con un tubo vuoto microcentrifuga tarato e un bisturi sterile al transilluminatore luce blu. Visualizza il tuo fine riparato DNA genomico e la fosmid marcatore dimensioni di controllo. Accise una fetta gel con un bisturi che migrarono con e leggermente sopra la posizione del marcatore fosmid dimensioni di controllo (accise una fetta gel che è 5-7 mm di larghezza) e trasferire la fetta alla provetta tarata. Eseguire un midrange ho PFG Marker sul gel come questo ti aiuta a non tagliare il gel troppo alto.
    Nota: laici involucro di plastica sul transilluminatore luce blu prima di mettere il gel su di esso per evitare la contaminazione incrociata e indossare gli occhiali di visualizzazione prima di accendere la luce blu. Non fette gel accise in cui il DNA genomico è più piccolo del marcatore fosmid dimensioni di controllo come questo si tradurrà in non desiderati cloni chimerici.
    È possibile tagliare e conservare le fette gel contenente minore o maggiore peso molecolare del DNA per la costruzione di fucile intero genoma o librerie BAC, rispettivamente.
    Interrompere I: la fetta gel recuperati (s) possono essere conservati a -20 ° C fino a un anno
  3. Pesare i tubi tarato e calcolare il peso della fetta gel (s). 1 mg di agarosio produrrà circa 1 ml di agarosio fuso.
  4. Fate sciogliere il basso punto di fusione di agarosio contenente il DNA genomico in un bagno d'acqua a 70 ° C per 10-15 minuti (non aggiungiamo tampone gelase). Dopo la vostra slice gel è completamente sciolto, trasferire rapidamente il tubo a 45 ° C.
    Nota: non vortice vostro campione per dissolvere come questo potrebbe taglio vostro DNA.
  5. Aggiungere 1 U (1ml) della preparazione enzimatica GELase per 100 ml di agarosio fuso. Incubare a 45 ° C per 1 ora e poi aggiungere più GELase (2-4 mL) e incubare per un'altra ora. Inattivare il calore GELase preparazione enzimatica a 70 ° C per 10 minuti.
    Posizionare la provetta in ghiaccio per 10 minuti e centrifugare la provetta a velocità massima (13.000 rpm) per 15 minuti per far sedimentare le particelle insolubili. Rimuovere con attenzione il sopranatante superiore e trasferirlo in una provetta da 15 ml Falcon e aggiungere 3 ml di acqua sterile per il tubo.
    Nota: evitare qualsiasi pipettaggio pellet agarosio. Come si aggiungono più di GELase incluso nel kit, ordiniamo più preparato enzimatico GELase separatamente.
  6. Trasferire la soluzione ad un Ultra-4 Amicon Unità centrifuga Filtro con membrana Ultracel-10 e girare il tubo a 4.000 g per 6-8 minuti ed eliminare il flusso attraverso. Centrifuga fino a quando la quantità di soluzione sul filtro è ridotto a circa 100 ~ 500 microlitri. Aggiungere altri 3 ml di acqua sterile per il tubo vuoto Falcon dall'alto e trasferire la soluzione al tubo Amicon e ripetere la fase di centrifugazione. Lavare una terza volta con 3 ml di acqua e gettare via il flusso attraverso di nuovo. Ridurre il volume finale a 50 - 100 l.
    Nota: si usa un rotore oscillante per la fase di centrifugazione, è sufficiente posizionare la centrifuga unità filtro Amicon in una provetta da 50 ml Falcon per tenerlo in posizione durante la centrifugazione. Amicon filtro trattiene in modo sicuro 50 ml di soluzione sul filtro anche dopo centrifugazione estesa.
  7. Trasferire la soluzione rimanente DNA dal tubo Amicon in un pre-lavati microcontrollore YM-50 Unità di centrifuga Filtro e risciacquare il tubo Amicon con altri 50 ml di acqua sterile per recuperare tutto il DNA. Centrifugare il microcontrollore YM-50 Unità centrifughe filtro in una microcentrifuga a 10.000 g fino a quando il filtro è ancora leggermente coperto con del liquido. Controllare ogni minuto se solo una piccola quantità di liquido che resta sul filtro. Capovolgere il filtro verso il basso e recuperare la soluzione di DNA da una fase di centrifugazione secondo a 1.000 g per 3 minuti in una provetta fresca. Il volume risultante non deve superare i 10-15 microlitri in totale, altrimenti il ​​vostro DNA potrebbe essere troppo diluita nella fase di legatura.
    Nota: fare attenzione a non girare il dispositivo filtro a completo essiccamento. Se la membrana è asciutto, quindi aggiungere l'acqua 10-15 microlitri sulla membrana, agitare delicatamente per 30 secondi e recuperare il DNA come descritto sopra.
  8. Quantificare la soluzione risultante DNA NanoDrop o saggio PicoGreen.
  9. Recuperato fine riparato il DNA è ora pronto per essere legata alla pCC1-fosmid vettore di clonazione. Scongelare la seguente soluzione sul ghiaccio e assicurarsi che il vettore di inserire il rapporto molare è di 10:1.
    Nota: 0,5 mcg pCC1-fosmid vettore vettore ~ ​​0,09 pmoli.
    0,25 mg di ~ 40 Kb di DNA ~ 0,009 pmoli DNA inserto
    Aumentando la quantità di DNA utilizzato nel passaggio legatura potrebbe essere utile se si deve ottenere cloni fosmid pochi dopo placcatura infetti E. coli suselezione di piatti.

    Aggiungere i reagenti nel seguente ordine e brevemente centrifugare la provetta per ottenere tutto il liquido sul fondo, tocca il tubo e girare di nuovo:

    • x microlitri di acqua sterile
    • 1 ml 10 volte più veloce-Link legatura tampone
    • 1 ml 10 mM ATP
    • 1 ml pCC1-fosmid vettore (0,5 mg / mL)
    • x DNA microlitri inserire concentrato (0,25 mg)
    • 1 ml veloce-Link DNA ligasi
    • Un volume di 10 microlitri di reazione totale
  10. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore e calore inattivare l'enzima per 10 minuti a 70 ° C.
    Stop II: miscela legatura conservare a -20 ° C oppure procedere alla fase di confezionamento dei fagi.
    Nota: Una reazione legatura singolo produrrà 10 3 -10 6 cloni a seconda della qualità del DNA ambientale. Sulla base della stima del numero di cloni che è necessario per la copertura particolare, è possibile scalare la reazione legatura. Se la legatura viene ingrandita, allora la quantità di estratto fago imballaggio devono essere scalati di conseguenza come descritto di seguito.

Fase III

Parte 1: Phage-packaging del vettore-inserto prodotto legatura

  1. Due o tre giorni prima del previsto striscia di confezionamento dei fagi hanno fornito EPI300-T1 ceppo placcatura R su una piastra di LB pianura e incubare per una notte a 37 ° C per ottenere singole colonie. Questo piatto può essere sigillato e conservato a 4 ° C per un uso futuro.
  2. Il giorno prima della reazione inoculare confezione da 50 ml di brodo LB + 10 mM MgSO 4 (aggiungere 500 microlitri 1M MgSO 4) con una singola colonia della piastra generato nel passaggio 1. Agitare a 225 giri al minuto e 37 ° C durante la notte.
  3. Il giorno delle reazioni imballaggio inoculare fresca brodo LB 50 ml + 10 mM MgSO 4 con 5 ml della cultura durante la notte preparata al punto 2. Crescono a 37 ° C ad un diametro esterno 600 da 0,8 a 1,0 e non superare OD 600 del 1.0! Diluire il campione prima di misurare il spettrofotometro in modo da ottenere un risultato preciso. Conservare le cellule in ghiaccio o a 4 ° C fino ulteriormente utilizzati.
    Nota: Stop III: la cultura può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 72 ore, se necessario, ma utilizzando una coltura fresca cresciuto è altamente raccomandato.
  4. Disgelo, su ghiaccio, il Estratti Lambda Packaging MaxPlax, 1 tubo per ogni reazione legatura effettuata in precedenza. Disgelo avrà 10-15 minuti. Nel frattempo, posto tubo 1,5 ml su ghiaccio di essere pre-raffreddata.
    Nota: non lasciare fago scongelati sul ghiaccio troppo lungo. In caso contrario, l'efficienza infezione dei fagi cadrà.
  5. Una volta scongelato immediatamente trasferire 25 ml di ogni estratto imballaggio per un secondo pre-raffreddata provetta da microcentrifuga 1,5 ml e posto sul ghiaccio. Ritorno estrarre imballaggio rimanenti - 80 ° C.
    Nota: non conservare l'estratto di imballaggio con ghiaccio secco o qualsiasi altra fonte di CO 2.
  6. Aggiungere 10 ml di reazione legatura ad ogni microlitri 25 del estratti scongelato in ghiaccio. Mescolare pipettando la soluzione più volte, evitare di introdurre bolle d'aria. Centrifugare brevemente le provette per avere tutto il liquido al fondo della provetta ed incubare le reazioni di confezionamento a 30 ° C per 90 min. Dopo 80 min di incubazione disgelo restanti estrarre imballaggio sul ghiaccio.
    Nota: utilizzare un bagno d'acqua anziché bloccare il riscaldamento per la fase di incubazione 30 ° C.
  7. Dopo 90 minuti di reazione confezione è completa aggiungere il restante 25 ml di estratto di imballaggio per ciascun tubo di reazione. Reazioni incubare per altri 90 minuti a 30 ° C. Dopo 90 min di incubazione aggiungere 100 ml di buffer di diluizione Phage preparato in ogni tubo di confezionamento e mescolare delicatamente.
    Nota: se il rendimento dovrebbe essere basso, alla fine, il vostro estratti dei fagi potrebbe essere troppo vecchio o sono stati esposti a ghiaccio secco o qualsiasi altra fonte di CO 2. Nella nostra esperienza, il confezionamento dei fagi a temperatura ambiente (2 tempi di 90 min) invece di 30 ° C seguita da una incubazione finale aggiuntivi per 2 ore a 30 ° C aumentato la quantità di cloni che ne derivano.
  8. Aggiungere 5 ml di cloroformio a ciascuna provetta e miscelare delicatamente risultante in un volume totale di 165 microlitri nel tubo. Un precipitato viscoso può formare dopo l'aggiunta del cloroformio, questo non interferisce con la produzione di biblioteca. Tuttavia evitare tale precipitato così come la fase di cloroformio organici quando pipettaggio le particelle dei fagi.
    Sosta IV: a questo punto le particelle dei fagi confezionato può essere conservato per diversi giorni a 4 ° C.
    Nota: per la migliore efficienza dei fagi infezioni, uso dei fagi appena confezionato.

Parte 2: L'infezione dell'ospite biblioteca E. coli

  1. Aggiungi fago confezionati a EPI300-T1 cellule ospiti R (OD 600 = 0,8-1,0) nel rapporto di 400 ml di EPI300 T1-R cellule per ogni 10 microlitri di particelle dei fagi. Per evitare qualsiasi pipettaggio cloroformio usiamo 125 ml di particelle dei fagi confezionati e 5 ml di preparato EPI300 T1-R cellule ospiti. Mescolare delicatamente e incubare a 37 ° C per 30 min.
    Nota: fare attenzione a non trasferire cloroformio alle cellule ospiti quando si rimuove la particella fago dal tubo di imballaggio fago. Se non siete sicuri, prendere meno delle particelle dei fagi confezionato.

Parte 3: Placcatura e titolazione

  1. Aggiungere 5-7 perle di vetro sterilizzati su quattro piccoli LB + 12,5 mg / ml cloramfenicolo piastre Petri.
  2. Stendere due volte 50 microlitri e due volte 10 microlitri della fago infetta EPI300 T1-R cellule in quattro piatti separati. Per garantire una distribuzione uniforme, aggiungete del brodo LB (~ 50 ml) per le piastre con il 10 microlitri di fago cellule infette. Agitare la piastra orizzontalmente per diffondere uniformemente le celle sul piatto. Lasciate asciugare la piastra per 15 minuti e poi rimuovere le perle invertendo la piastra.
    Nota: queste placche sono utilizzate per determinare il numero di trasformanti e per calcolare le diluizioni appropriate necessarie nella fase di raccolta per evitare la colonia colonia densità troppo alta.
  3. Posizionare le piastre a testa in giù in un incubatore a 37 ° C per 16 a 24 ore fino a 48 ore fino a formare delle colonie. Controllare le piastre dopo 24 ore per evitare cloni rapida crescita di crescere in colonie prossimo.
  4. Nel frattempo, raccogliere le cellule residue sinistra-over dal contagio 5 mL per centrifugazione a 3.500 g per 10 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di LB / 20% glicerolo al tubo. Risospendere il pellet cellulare microlitri e aliquota al 100 ciascuno in 2 mL provetta Microbank ™. Congelare immediatamente e conservare a -80 ° C per un ulteriore uso nella colonia raccolta passo.
  5. Il giorno dopo, contare il numero di cloni sui piatti e determinare il titolo. Assicurati di includere il fattore di diluizione corretta per calcolare la quantità totale di fosmid-cloni.
    Nota: questa procedura genera tra 10.000 e 50.000 fosmid-cloni in totale, ma a seconda della qualità e purezza del DNA estratto ambientale, una gamma tra 3.000 fino a 80.000 cloni fosmid si osserva.

Fase IV

Parte 1: Agar-e ben preparazione piatti

  1. Versare nei piatti dei media come segue; comprendono cloramfenicolo 12,5 microgrammi per ml di LB:
    • 100X15mm petri piatto: agar LB 25mL
    • 150X15mm petri piatto: 50mL agar LB
    • 245X245mm piazza piatto biologico: agar LB 250mL
    Nota: è importante versare i media su una superficie ben livellata per rendere la profondità di agar in modo uniforme in tutto il piatto. Si consiglia di utilizzare piastre 245X245 mm per le biblioteche fosmid in modo da non dover gestire molti piatti.
  2. Scongelare il vostro stock di glicerolo contenente i cloni preparato fosmid sul ghiaccio. Stendere la quantità appropriata per la piastra che si desidera utilizzare in base alle titolo calcolato (preparando il brodo glicerolo si concentra inoltre le cellule ~ 5 volte). Tempo di incubazione per la crescita cellulare è di 24 ore a 37 ° C.
    Smettere di V: quando colonie formate, negozio piastre di agar sigillato a 4 ° C fino a un mese fino a quando non vengono utilizzati nella fase di raccolta colonia.
    Nota: le colonie devono essere distribuite in modo uniforme, abbastanza distanti gli uni dagli altri e dovrebbe crescere di circa 1 mm di diametro. Placcatura celle utilizzando perline di vetro in grado di generare una buona separazione tra le colonie. Su un piatto 100X15mm Petri, in genere 150 ~ 250 colonie sono una buona densità di efficienza più alti del robot di picking e di 22 x 22 cm, non più di 2.000 colonie dovrebbe essere ottenuto.
  3. Nei giorni di raccolta colonia, preparare 96 o 384 pozzetti pieni di brodo LB integrato con cloramfenicolo 12,5 mcg per ml di brodo e 20% glicerolo per la conservazione della libreria a -80 ° C. Piastre vengono riempite con il sistema automatizzato QFill3 piastra riempimento come descritto di seguito.
  4. Autoclave 2 set di bottiglie di vetro (500 ml), coperchi e tubi in silicone. Non molteplici autoclave, compreso il montaggio ago e flangia di montaggio. Assemblare QFill3 vicino a una fiamma becco Bunsen o all'interno di una cappa di creare e mantenere un ambiente sterile.
    Nota: assicurarsi che il tubo di silicone viene inserito nella valvola a manicotto premendo il pizzico valvola attivatore e facendo scorrere il tubo completamente nella valvola. (Questo funziona come un freno per l'erogazione media alla colonna successiva).
  5. Sterilizzare gli aghi di erogazione passando attraverso ~ 50 ml di 1% di candeggina, autoclave dH 2 O e 80% di etanolo, uno alla volta e mettere un coperchio della scatola punta sulla piattaforma per la raccolta dei rifiuti soluzioni. Dopo la sterilizzazione, il cambiamento al set composto da altri tubi bottiglia, coperchio e silicio.
  6. Riempire bottiglia con ~ 300 ml di mezzo. Esegui abbastanza mezzo attraverso di sbarazzarsi di ogni residuo di etanolo dalla fase di pulizia. Una volta che il tubo viene pulito, carico di un piatto ben 96/384 sulla piattaforma. Premere il tasto "start" per riempire il vostro piatto, ogni bene dovrebbe essere riempito con 200 ml di brodo LB preparati. Per pulire gli aghi di erogazione, eseguire ~ 50 ml di etanolo all'80% attraverso.
    Nota: assicurarsi che il piatto è ben etichettati prima del riempimento.

Parte 2: raccolta di setup colonia robot

  1. Stiamo usando il clone raccolta robot QPix2 accondo il manuale d'uso s. Gli utenti dovrebbero essere a conoscenza di movimentazione loro robot e come impostare il tutto per garantire la più alta efficienza di raccolta.
  2. Per creare un ambiente sterile intorno alla zona di raccolta clone, accendere la luce UV per 30 minuti. Mentre la luce UV è accesa, preparare 500 ml di 1% di candeggina, 500 ml di dH sterili 2 O e 500 mL di etanolo 80%. Quando la luce UV si spegne riempire i vassoi come indicato. Sempre versare le soluzioni nei vassoi soluzione correttamente etichettati. Da dietro in avanti compilare l'1% di candeggina, poi in autoclave dH 2 O e 80% di etanolo nel cassetto anteriore. Assicurarsi che essi sono pieni. Aghi di raccolta non possono essere lavati correttamente senza soluzione di lavaggio sufficiente.
    Nota: etanolo 80% monitorare nel tempo. Sarà evaporare e deve essere rabboccato.
  3. Dopo aver impostato i parametri per la raccolta ottimali, le piastre di agar preparata con cloni fosmid e piastre bene tra i pali nel Q-Pix nell'area di lavoro. Assicurarsi di aver adottato tutte le copre la piastra di sconto!
  4. Piastre devono essere stretti contro angolo anteriore destro, in modo che non possono muoversi durante il prelievo. Quindi chiudere il pannello frontale.
    Nota: Questo è molto importante!
  5. Una volta che tutti i parametri sono impostati la procedura di raccolta può iniziare. Quando tutti la raccolta è completata lavare i pennelli ei vassoi con acqua deionizzata e impostare in panchina ad asciugare. Pulire tutte le cadute che si sono verificati, e pulire l'interno del Q-Pix con 80% di etanolo.

Parte 3: incubazione Pernottamento e stoccaggio biblioteca

  1. Assicurarsi che tutte le lastre glicerolo stock sono etichettati, e metterli nel 37 ° C incubatore per 24 ore. Lascia una nota sul incubatore che contiene la data, numero di piastre incubate, il tempo di incubazione, tempo per la rimozione e le proprie iniziali.
  2. Per l'archiviazione a lungo, mettere il incubazioni cresciuto durante la notte in un congelatore C ° -80.

Rappresentante dei risultati:

Il protocollo presentato descrive la procedura come generare una libreria ambientale fosmid per acquisire il contenuto genetico di una comunità microbica in un determinato habitat. Questo protocollo dovrebbe creare una libreria fosmid che sia rappresentativo per il contenuto genetico l'ambiente controllato e dovrebbe consentire al lettore di modificare e ottimizzare le fasi critiche se la quantità di cloni fosmid conseguito al termine dell'intera procedura è troppo bassa.

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Discussion

Una procedura viene descritto come generare più efficiente un grande inserto biblioteca fosmid con il DNA genomico derivato da un campione d'acqua costiere. A monte di estrazione del DNA genomico è descritta in un protocollo separato [3].

Mentre il fosmid-libreria di produzione è un processo multistep, piano di almeno due o tre settimane, in tempo per l'intera procedura compresi tutti i passaggi quattro presentati. L'estrazione del DNA genomico è il passo più importante e tutte le fasi a valle contare sulla qualità e la quantità di estratto il DNA genomico, in modo da considerare la spesa abbastanza tempo per questo passaggio e un lavoro serio. Controllo qualitativo e quantitativo del DNA estratto è molto importante. Può accadere che il numero di cloni fosmid è bassa, soprattutto se questa è la prima biblioteca che si sta per fare. Poiché la costruzione della libreria fosmid di per sé è dritto in avanti, il fallimento è dovuto principalmente qualità insufficiente e / o la quantità del vostro DNA genomico estratto e purificato. Considerare a ri-estrarre il DNA genomico e di prestare particolare attenzione le fasi nella purificazione del DNA e di recupero se la costruzione della libreria non è riuscita.

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Disclosures

Non ho nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. MT e SL erano supportati da borse di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE). MT inoltre ricevuto il sostegno borsa di studio della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

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References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

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