Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

Biology

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Summary

Bau eines Fosmid Bibliothek mit Umwelt-genomischer DNA aus der vertikalen Tiefe Kontinuum einer saisonal hypoxischen Fjord isoliert beschrieben. Der resultierende Klon-Bibliothek ist in 384-Well-Platten aufgenommen und archiviert für Downstream-Sequenzierung und funktionelle Screening durch die Anwendung eines automatisierten Kolonie Kommissioniersystem.

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Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

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Abstract

Die überwiegende Mehrheit der Mikroben in der Natur bestehen derzeit noch unzugänglich traditionellen Anbaumethoden. Während des letzten Jahrzehnts, Kultur-unabhängigen Umweltgutachter genomische (

Protocol

Fosmid Bibliothek Konstruktion hat sich in vier Stufen und in mehrere Teile (siehe Abb. 1 für eine Übersicht) unterteilt unterteilt.

Step I (siehe Protokoll "DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter" [3])

Teil 1: Enzymkatalysierte Zelllyse

Teil 2: Reinigung von Umwelt-DNA durch CsCl-Dichtegradientenzentrifugation und DNA-Gewinnung

Teil 3: Qualitätskontrolle der extrahierten DNA durch Gelelektrophorese

Step II

Teil 1: Enzymatische Modifizierung Schritten erholt Umwelt DNA

Alle notwendigen Reagenzien für die End-Reparatur Schritt des Umwelt-DNA sind in der pCC1 Fosmid Bibliothek Production Kit von EPICENTRE enthalten. Idealerweise sollte Ihr genomische DNA bis 0,5 ug / ul eingestellt werden.

  1. Thaw alle Reagenzien auf Eis, kombinieren Sie die folgenden und kurz zentrifugieren das Rohr, um alle Flüssigkeit auf den Boden zu bekommen:
    • x ul sterilem Wasser
    • 8 ul 10x End-Reparatur-Puffer
    • 8 ul 2,5 mM dNTP-Mix
    • 8 ul 10 mM ATP
    • bis zu 20 ug geschert Insert-DNA (~ 0,5 ug / ul)
    • 4 ul end-Reparatur-Enzym-Mix
    • 80 ul Reaktionsvolumen
  2. Inkubieren bei Raumtemperatur für eine Mindestzeit von 45 Minuten bis zu 60 Minuten und Hitze inaktiviert das Enzym-Mix bei 70 ° C für 10 min (in der Zwischenzeit bereiten einem niedrig schmelzenden Agarosegel für die spätere Größe-Auswahl der End-Reparatur DNA, siehe unten).

Teil 2: Size-Auswahl der genomischen DNA durch Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE)

  1. Re-suspend 1,5 g niedrig schmelzende Agarose in 150 ml 1,0-fach TAE-Laufpuffer und fügen Sie einen kleinen Rührfisch. Bedecken Sie den Kolben mit microwavable Plastikfolie und kochen schnell in der Mikrowelle bis Agarose vollständig gelöst ist. Stir-Lösung, bis es kalt genug, um in den Gelträger gießen ist (~ 60 ° C).
    Hinweis: nicht enthalten Ethidiumbromid oder SYBR Gold-entweder im Gel oder in den Laufpuffer.
  2. Montieren Sie den Gelträger Ihre Gel gegossen, und wählen Sie einen Kamm, die Ihnen ausreichend Platz für die komplette End-Reparatur-Mix in ein oder zwei Brunnen (80 ul plus angemessene Menge an Ladepuffer) zu laden.
  3. Gießen Sie 2,2 L von 1,0 X TAE in die Elektrophoresekammer und schalten Sie das Gerät mit dem Laufpuffer zirkulieren und stellen Sie die Kühleinrichtung bis 14 ° C. Die Pumpe sollte bei 70 Umdrehungen pro Minute laufen, um eine ausreichende Durchblutung der Laufpuffer sicher und halten Sie die Puffer bei 14 ° C.
  4. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in das Gel Fach auf eine ebene Oberfläche gut, wenn es abgekühlt ist und stellen Sie sicher, Luftblasen vermeiden. Sicherstellen, dass die geschmolzene Agarose ist auch auf dem Gel Kamm, ansonsten entfernen Sie den Kamm und steckte es wieder in die geschmolzene Agarose. Sobald das Gel erstarrt ist, entfernen Sie den Kamm und laden Sie eine MidRange ich PFG Marker in der vierten und des Gels. Extrude Agarose aus dem Gel Spritze und in Scheiben schneiden ein kleines Plug aus dem Ende mit einem Skalpell. Setzen Sie den Stecker an der Vorderseite des Brunnens und Dichtung mit dem geschmolzenen Agarose. Legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer.
    Hinweis: Umgang mit Ihren Agarosegel sehr sorgfältig, wie niedrig schmelzende Gele Bremse leicht. Prüfen Sie, ob der Laufpuffer wurde bis auf 14 ° C abgekühlt, bevor Sie Ihren Laden Gel starten. Wenn Ihr Brunnen durch Agarose-Look blockiert, versuchen Sie Folgendes beim nächsten Mal: ​​Bevor Sie den Kamm entfernen aus dem Gel, 1-2 mL TAE-Puffer um den Kamm, das wird in schöner Brunnen führen.
  5. In den ersten gut Last 5 ul λ HindIII verdaut, gefolgt von 1 ul der Fosmid Kontrolle Größenmarker (EPICENTRE, 100 ng / ul). Fügen Sie 10 ul sterilem Wasser, um die Größe Marker in einem Mikrozentrifugenröhrchen sowie eine entsprechende Menge an Ladepuffer. Das größere Volumen macht es einfacher, das Gel laden. Direkt neben dem Fosmid Marker laden Sie Ihre End-repariert und hitzeinaktiviertem mischen sich mit einer entsprechenden Menge an Ladepuffer. Schließen Sie den Deckel und das Programm die Einstellungen.
    Hinweis: Wir empfehlen wirklich Laden verschiedener Mengen von anderen DNA-Leitern auf rund Quantifizierung der DNA-Menge oder das Ausmaß der Scherung der genomischen DNA sichtbar zu machen. Ideale Größe Marker λ DNA-HindIII Digest-und Midrange-I PFG Marker (beide NEB).
  6. Programmieren Sie die Einstellungen: Verwenden Sie Auto-Algorithmus, wenn Ihr PFGE-System ist mit dieser ausgestattet. Das Programm berechnet automatisch die Einstellung, die Sie brauchen, um DNA von einem bestimmten Größenbereich zu trennen. Einstellungen verwendet werden: DNA Größenbereich 2-250 Kb; Kalibrierfaktor: 1; Steigung: [6 V / cm]; Laufzeit: 12:00 Uhr; eingeschlossene Winkel: 120 °; erste Schaltzeit: 0,1 sec; letzte Schaltzeit : 21.79 sec; ramping Faktor a = linear.
  7. Zur Visualisierung Ihrer DNA, pour 250 ml 1,0-fach TAE-Puffer in einen Behälter und fügen 25 ul SYBR 10.000x Gold; vorsichtig mischen, bevor Sie Ihr Gel statt in die Lösung. Stain Ihre Gel für 1 h im Dunkeln wie SYBR Gold-Licht empfindlich ist.
    Hinweis: Griff Ihr eingarose Gel sehr sorgfältig, wie niedrig schmelzende Gele Bremse leicht.

Teil 3: DNA-Recovery durch Gel-Extraktion und Ligation von DNA wieder auf die Fosmid Klonierungsvektor

Alle Reagenzien für diesen Teil sind in der EPICENTRE Fosmid-Bibliothek Produktions-Kit enthalten.

  1. In der Zwischenzeit bereiten einem Wasserbad bei 70 ° C und einer bei 45 ° C für die Gel-Verdau Schritt.
  2. Nehmen Sie Ihre gefärbten Gel zusammen mit einem leeren tariert Mikrozentrifugenröhrchen und ein steriles Skalpell an das blaue Licht Transilluminator. Visualisieren Sie Ihre End-Reparatur genomische DNA und die Fosmid Kontrolle Größenmarker. Excise ein Gel-Schnitte mit dem Skalpell, die mit und etwas über die Position des Fosmid Kontrolle Größenmarker (Verbrauchsteuern ein Gel Scheibe, welche 5-7 mm breit ist) migriert und übertragen Sie die Scheibe an den tariert Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie einen MidRange ich PFG Marker auf dem Gel, da dies hilft Ihnen, nicht schneiden das Gel zu hoch.
    Hinweis: legen Plastikfolie auf das blaue Licht Transilluminator, bevor Sie Ihr Gel legte es um eine Kreuzkontamination zu vermeiden und tragen die Sichtscheiben, bevor Sie das blaue Licht. Nicht Verbrauchsteuern Gelscheiben wo die genomische DNA ist kleiner als die Fosmid Kontrolle Größenmarker, da dies zu unerwünschten Chimären führen wird.
    Sie können schneiden und speichern Gelscheiben mit niedrigeren oder höheren Molekulargewicht DNA für den Bau von Whole Genome Shotgun oder BAC-Bibliotheken, bzw..
    Stop-I: die wiederhergestellten Gelscheibe (s) kann bei -20 ° C gelagert werden bis zu einem Jahr
  3. Wiegen Sie die tariert Rohre und berechnen das Gewicht des Gelscheibe (s). 1 mg Agarose wird Ausbeute ca. 1 ul geschmolzene Agarose.
  4. Melt der niedrig schmelzenden Agarose mit Ihrem genomische DNA in einem Wasserbad bei 70 ° C für 10-15 Minuten (wir wissen nicht hinzuzufügen Gelase Puffer). Nach Ihrer Gelscheibe vollständig geschmolzen ist, übertragen Sie die Röhre schnell um 45 ° C.
    Hinweis: nicht vortexen Ihre Probe zu helfen aufzulösen, da dies Scher Ihre DNA.
  5. Add 1 U (1μl) der GELase enzymatischen Zubereitung pro 100 ul von geschmolzener Agarose. Inkubation bei 45 ° C für 1 Stunde und fügen Sie dann mehr GELase (2-4 ul) und Inkubation für eine weitere Stunde. Hitze inaktiviert das Enzym GELase Vorbereitung bei 70 ° C für 10 Minuten.
    Das Röhrchen auf Eis für 10 min und Zentrifuge das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit (13.000 rpm) für 15 min zu Pellets unlösliche Partikel. Entfernen Sie vorsichtig die obere Überstand und die Übertragung auf einen 15-ml-Falcon-Röhrchen und 3 ml sterilem Wasser auf das Rohr.
    Hinweis: Vermeiden Sie jede Pipettieren pelletiert Agarose. Als wir mehr GELase als im Kit, wir extra bestellen GELase Enzympräparation separat aufgenommen.
  6. Übertragen Sie die Lösung zu einem Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Einheit mit Ultracel-10-Membran und drehen Sie das Rohr bei 4.000 g für 6-8 Minuten und entsorgen Sie die Durchströmung. Zentrifuge, bis die Menge der Lösung auf dem Filter auf etwa 100 reduziert wird ~ 500 ul. Add another 3 ml steriles Wasser in den leeren Falcon-Röhrchen von oben und die Lösung der Amicon Rohr und Wiederholung der Zentrifugation. Wash ein drittes Mal mit 3 ml Wasser und entsorgen Durchströmung wieder. Reduzieren Sie die Endvolumen von 50 bis 100 ul.
    Hinweis: Wir verwenden eine Ausschwingrotor für den Zentrifugationsschritt; einfach die Amicon Zentrifugalkraft Filtereinheit in einem 50 mL Falcon-Röhrchen, um es in Position zu halten während der Zentrifugation. Amicon-Filter sicher ein 50 ul-Lösung auf dem Filter auch nach längerem Zentrifugieren.
  7. Übertragen Sie die restlichen DNA-Lösung aus der Amicon Rohr in einen pre-washed Microcon YM-50 Kreiselpumpen Filter Unit und spülen Sie die Amicon Rohr mit einem Aufschlag von 50 ul sterilem Wasser für alle DNA erholen. Zentrifugieren Sie die Microcon YM-50 Zentrifugalfilter Einheit in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 g, bis der Filter ist immer noch leicht mit Flüssigkeit bedeckt ist. Prüfen Sie jede Minute, wenn nur eine kleine Menge der Flüssigkeit auf dem Filter zurückbleibt. Drehen Sie den Filter auf den Kopf und Wiederherstellung Ihrer DNA-Lösung durch einen zweiten Zentrifugationsschritt bei 1.000 g für 3 min in ein frisches Reaktionsgefäß. Das resultierende Volumen sollte nicht mehr als 10-15 ul insgesamt, sonst wird Ihre DNA könnte auch in der Ligationsschritt verdünnt werden.
    Hinweis: Achten Sie darauf, Ihren Filter Gerät Spin zur Trockne. Wenn Ihre Membran ist trocken, fügen Sie dann 10-15 ul Wasser auf die Membran leicht bewegen für 30 Sekunden und Wiederherstellung Ihrer DNA wie oben beschrieben.
  8. Quantifizieren Sie Ihre daraus resultierenden DNA-Lösung durch NanoDrop oder PicoGreen Assay.
  9. Recovered end-reparierte DNA ist nun bereit, um die pCC1-Fosmid Klonierungsvektor ligiert werden. Thaw die folgende Lösung auf Eis und sicherstellen, dass der Vektor Molverhältnis Einsatz ist 10:1.
    Hinweis: 0,5 ug pCC1-Fosmid Vektor ~ 0,09 pmol Vektor.
    0,25 ug von ~ 40 Kb Insert-DNA ~ 0,009 pmol Insert-DNA
    Eine Erhöhung der Menge an DNA im Ligationsschritt verwendet werden könnten hilfreich sein, wenn Sie nur ein paar Fosmid Klone sollten erhalten nach dem Ausplattieren E. infiziert coli-Zellen aufAuswahl-Platten.

    Fügen Sie die Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge mischen und kurz zentrifugieren das Rohr, um alle Flüssigkeit auf den Boden zu bekommen, tippen Sie auf das Rohr und drehen wieder:

    • x ul sterilem Wasser
    • 1 ul 10x Schnell-Link Ligationspuffer
    • 1 ul 10 mM ATP
    • 1 ul pCC1-Fosmid Vektor (0,5 ug / ul)
    • x ul konzentriert Insert-DNA (0,25 ug)
    • 1 ul Schnell-Link DNS-Ligase
    • 10 pl Reaktionsvolumen
  10. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden und Wärme Inaktivierung des Enzyms für 10 Minuten bei 70 ° C.
    Stop II: store Ligationsansatz bei -20 ° C oder fahren Sie mit der Phagen-Verpackungen Schritt.
    Hinweis: Eine einzelne Ligationsreaktion wird 10 3 -10 6 Klone in Abhängigkeit von der Qualität der Umwelt DNA herzustellen. Basierend auf der geschätzten Anzahl von Klonen, die für bestimmte Abdeckung erforderlich ist, können Sie vergrößern die Ligationsreaktion. Wenn die Ligation ist verkalkt, dann ist die Menge an Phagen Verpackung Extrakt sollte entsprechend sein, wie unten beschrieben skaliert.

Step III

Teil 1: Phage-Verpackung von Vektor-Insert Ligationsprodukt

  1. Zwei oder drei Tage vor dem beabsichtigten Phagen Verpackung Streifen aus EPI300-T1 R plating Belastung auf einer Ebene LB-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C zur Verfügung gestellt, um einzelne Kolonien zu erhalten. Diese Platte kann versiegelt und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden.
  2. Am Tag vor der Verpackung Reaktion impfen 50 ml LB-Medium + 10 mM MgSO 4 (add 500 ul 1M MgSO 4) mit einer einzigen Kolonie von der Platte in Schritt 1 generiert. Schütteln bei 225 rpm und 37 ° C über Nacht.
  3. Der Tag der Verpackung Reaktionen impfen frische 50 ml LB-Medium + 10 mM MgSO 4 mit 5 ml der Übernacht-Kultur in Schritt 2 erstellt. Wachsen bei 37 ° C zu einer OD 600 von 0,8 bis 1,0 und nicht mehr als OD 600 von 1,0! Verdünnen Sie Ihre Probe vor der Messung auf dem Spektralphotometer, so dass Sie ein genaues Ergebnis zu bekommen. Shop-Zellen auf Eis oder bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    Hinweis: Stop III: Kultur kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu 72 Stunden, wenn nötig, aber mit einem frischen aufgewachsen Kultur ist sehr zu empfehlen.
  4. Auftauen, auf Eis, trug die MaxPlax Lambda Packaging Auszüge, 1 Tube für jeden Ligationsreaktion aus zuvor. Das Auftauen dauert 10-15 Minuten. Inzwischen Ort 1,5 ml Röhrchen auf Eis zu sein vorgekühlte.
    Hinweis: lassen Sie nicht aufgetaut Phagen auf dem Eis zu lang. Ansonsten Phageninfektion Effizienz sinkt.
  5. Nach dem Auftauen sofort in 25 ul jeder Verpackung zu extrahieren, um eine zweite vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis stellen. Zurück verbleibenden Verpackungen zu extrahieren, um - 80 ° C.
    Hinweis: Nicht gespeichert wird die Verpackung Extrakt mit Trockeneis oder anderen CO 2-Quelle.
  6. Add 10 ul der Ligationsreaktion zu je 25 ul des aufgetauten Extrakte auf Eis. Mix durch Pipettieren der Lösung mehrmals zu vermeiden Einführung von Luftblasen. Kurz zentrifugieren, um alle Flüssigkeit auf den Boden der Röhre zu bekommen und inkubieren der Verpackung Reaktionen bei 30 ° C für 90 min. Nach 80 min Inkubation Tauwetter verbleibenden Verpackungen Extrakt auf Eis.
    Anmerkung: Mit einem Wasserbad statt Heizblock für die 30 ° C Inkubationsschritt.
  7. Nach 90 min Verpackung Reaktion ist beendet, fügen Sie die restlichen 25 ul der Verpackung Extrakt zu jedem Reaktionsgefäß. Inkubieren Reaktionen für weitere 90 min bei 30 ° C. Nach 90 min Inkubation mit 100 ul der vorbereiteten Phage Verdünnungspuffer in jede Verpackung Rohr und vorsichtig mischen.
    Hinweis: Wenn Sie Ihre Effizienz sollte am Ende schwach ist, Phagen-Extrakte könnten zu alt oder zu Trockeneis oder anderen CO 2-Quelle ausgesetzt. Nach unserer Erfahrung Phagen Verpackung bei Raumtemperatur (2 mal 90 min) statt 30 ° C durch eine abschließende zusätzliche Inkubation für 2 Stunden bei 30 ° C stieg die Zahl der erhaltenen Klone.
  8. Add 5 ul Chloroform in jedes Röhrchen geben und vorsichtig mischen sich in einem Gesamtvolumen von 165 ul in die Röhre. Ein viskoser Niederschlag kann nach Chloroformzusatz Form, das wird nicht mit Bibliothek Produktion stören. Doch dies zu vermeiden Niederschlag sowie die organische Chloroformphase beim Pipettieren der Phagenpartikel.
    Stop-IV: an dieser Stelle die verpackten Phagenpartikel kann für einige Tage bei 4 ° C gelagert werden
    Hinweis: für die beste Phageninfektion Effizienz, Nutzung frisch verpackten Phagen.

Teil 2: Eine Infektion der Bibliothek Host E. coli

  1. Add verpackten Phagen an EPI300-T1 R Wirtszellen (OD 600 = 0,8 bis 1,0) im Verhältnis von 400 ul EPI300-T1 R-Zellen für alle 10 ul Phagenpartikel. Um zu vermeiden, Pipettieren jede Chloroform verwenden wir 125 ul des verpackten Phagenpartikel und 5 ml vorbereitet EPI300-T1 R Wirtszellen. Vorsichtig mischen und dann bei 37 ° C für 30 min.
    Hinweis: Achten Sie darauf, Chloroform, die Wirtszellen zu übertragen, wenn Sie die Phagenpartikel zu entfernen aus dem Phagen Verpackungshülse. Wenn Sie unsicher sind, nehmen weniger der verpackten Phagenpartikel.

Teil 3: Beschichtung und Titrierung

  1. Fügen Sie 5-7 sterilisiert Glasperlen auf vier kleinen LB + 12,5 pg / mL Chloramphenicol Petrischalen.
  2. Verbreiten Sie zwei mal 50 mu l und zwei mal 10 ul des Phagen infiziert EPI300-T1 R-Zellen auf vier getrennte Platten. Um sicherzustellen, gleichmäßige Verteilung, fügen Sie einige LB-Bouillon (~ 50 ul), die Platten mit den 10 ul des Phagen infizierten Zellen. Schütteln Sie die Platte horizontal gleichmäßig verteilt die Zellen auf der Platte. Lassen Sie die Platte trocken für 15 min und entfernen Sie dann die Perlen durch Umdrehen der Platte.
    Hinweis: diese Platten werden verwendet, um die Anzahl der Transformanten zu ermitteln und die geeigneten Verdünnungen notwendig in der Kolonie Kommissionierung Schritt zu hohe Dichte Kolonie zu vermeiden berechnen.
  3. Legen Sie die Platten kopfüber in einem 37 ° C Inkubator für 16 bis 24 Stunden bis 48 Stunden, bis sich Kolonien bilden. Überprüfen Sie Platten nach 24 Stunden, um schnell wachsende Klone wachsen in Nachbars Kolonien zu verhindern.
  4. Inzwischen ernten die restlichen Zellen aus dem 5 mL Infektion über links durch Zentrifugation bei 3.500 g für 10 Minuten bei 4 ° C. Überstand verwerfen. 1 ml LB / 20% Glycerin auf das Rohr. Re-suspend das Zellpellet und Aliquot auf 100 ul jeweils in 2 ml-Kryoröhrchen Röhren. Sofort einfrieren und bei -80 ° C für die weitere Verwendung in der Kolonie Kommissionierung Schritt.
  5. Am nächsten Tag, zählen die Anzahl der Klone auf den Platten und bestimmen den Titer. Achten Sie auf die korrekte Verdünnungsfaktor sind auf die Gesamtmenge der Fosmid-Klone zu berechnen.
    Hinweis: Dieses Verfahren erzeugt zwischen 10.000 und 50.000 Fosmid-Klone insgesamt, jedoch abhängig von der Qualität und Reinheit der extrahierten DNA Umwelt, ein Bereich zwischen 3.000 bis zu 80.000 Fosmid Klone beobachtet wird.

Schritt IV

Teil 1: Agar-und Well-Platten Vorbereitung

  1. Gießen Medien in Platten wie folgt; gehören 12,5 ug Chloramphenicol pro ml LB:
    • 100x15mm Petrischale: 25ml LB-Agar
    • 150x15 Petrischale: 50ml LB-Agar
    • 245X245mm Platz Bioassay Platte: 250ml LB-Agar
    Hinweis: Es ist wichtig, die Medien, auf einem gut ebenen Fläche gießen zu einer Tiefe von Agar gleichmäßig zu machen über die Platte. Wir empfehlen die Verwendung 245X245 mm Platten für Fosmid Bibliotheken, so dass Sie nicht haben, um viele Platten zu behandeln.
  2. Thaw Ihre Glycerin Lager mit der vorbereiteten Fosmid Klone auf dem Eis. Verbreiten Sie die Höhe angemessen für die Platte soll auf der Grundlage Ihrer berechneten Titer verwenden (Vorbereitung der Glycerin Lager zusätzlich konzentriert sich Ihre Zellen ~ 5-fach). Inkubationszeit für das Zellwachstum ist 24 Stunden bei 37 ° C.
    Stop-V: wenn Kolonien gebildet, speichern verschlossenen Agarplatten bei 4 ° C für bis zu 1 Monat, bis sie in der Kolonie Kommissionierung Schritt verwendet werden.
    Hinweis: Kolonien müssen gleichmäßig sein, Verbreitung weit genug von einander und sollten ca. 1 mm im Durchmesser wachsen. Plating Zellen mit Glasperlen können eine gute Trennung zwischen Kolonien. Auf einer 100x15mm Petrischale, die normalerweise 150 ~ 250 Kolonien sind eine gute Dichte für höchste Roboter Kommissionierung Effizienz und für 22 x 22 cm, sollte nicht mehr als 2.000 Kolonien erhalten werden.
  3. An den Tagen der Kolonie Kommissionierung, Vorbereitung 96 oder 384-Well-Platten mit LB-Medium mit 12,5 ug Chloramphenicol pro ml Brühe sowie 20% Glycerin für Bibliotheks-Lagerung bei -80 ° C ergänzt gefüllt Well-Platten werden mit dem automatisierten QFill3 Platte Füllsystem gefüllt, wie im Folgenden beschrieben.
  4. Autoclave 2 Sätze von Glasflaschen (500 ml), Deckel und Silikonschlauch. Nicht autoklavieren vielfältig, darunter Nadeleinheit und Montageflansch. Montieren QFill3 Nähe einer Bunsenbrennerflamme oder innerhalb einer Haube zu erstellen und zu halten, eine sterile Umgebung.
    Hinweis: stellen Sie sicher, dass der Silikonschlauch in das Quetschventil wird durch Drücken der Quetschventil Aktivator und schieben Sie das Rohr vollständig in das Ventil eingesetzt. (Dies funktioniert wie eine Bremse für die Abgabe Medium, um die nächste Spalte).
  5. Sterilisieren Dosiernadeln, indem sie durch ~ 50 ml 1% Bleichmittel, autoklaviert dH 2 O und 80% Ethanol, ein zu einer Zeit und Ort einen Tipp box Deckel auf die Plattform, um Abfall-Lösungen sammeln. Nach der Sterilisation, auf die andere bestehend aus Flasche, Deckel und Silikonschlauch ändern.
  6. Fill-Flasche mit ca. 300 ml Medium. Run genug Medium, um loszuwerden, alle verbleibenden Ethanol aus dem Reinigungsschritt. Sobald der Schlauch gereinigt, laden Sie eine 96/384 Well-Platte auf der Plattform. Drücken Sie auf "Start" zu füllen Ihren Teller, jeder sollte gut mit 200 ul vorbereitet LB Brühe gefüllt werden. Zur Reinigung Dosiernadeln, laufen ~ 50 ml 80% igem Ethanol durch.
    Hinweis: Vergewissern Sie sich, Well-Platte vor der Abfüllung gekennzeichnet ist.

Teil 2: Kolonie Pickroboter Setup

  1. Wir sind mit dem Klon Pickroboter QPix2 acCording, um den Benutzer s Handbuch. Benutzer sollten vertraut sein Umgang mit ihren Roboter und wie Sie alles, um höchste Effizienz zu garantieren Kommissionierung.
  2. So erstellen Sie eine sterile Umgebung des Klon Kommissionierung, auf dem UV-Licht für 30 Minuten einzuschalten. Während die UV-Licht ist, bereiten 500 ml 1% Bleichmittel, 500 ml sterile dH 2 O und 500 ml 80% Ethanol. Wenn die UV-Licht schaltet füllen die Schalen als gekennzeichnet. Immer gießen Sie die Lösungen in den korrekt gekennzeichnet Lösung Tabletts. Von hinten nach vorne in 1% Bleichmittel füllen, anschließend autoklaviert dH 2 O und 80% Ethanol in den vorderen Schacht. Stellen Sie sicher, sie sind voll. Picking-Nadeln können nicht richtig ohne ausreichende Waschlösung gewaschen werden.
    Hinweis: Monitor 80% Ethanol im Laufe der Zeit. Er verdampft und muss nachgefüllt werden.
  3. Nach dem Einrichten der Parameter für die optimale Aufnahme, legen Sie die vorbereiteten Agarplatten mit Fosmid Klone und Well-Platten zwischen den Pfosten in der Q-Pix Arbeitsbereich. Stellen Sie sicher, dass Sie getroffen haben, all die Platte deckt off!
  4. Die Platten sollten dicht sein gegen vorderen rechten Ecke, so kann es nicht bei der Kommissionierung zu bewegen. Dann schließen Sie die Frontplatte.
    Hinweis: Dies ist äußerst wichtig!
  5. Nachdem alle Parameter eingestellt sind die Kommissionierung kann beginnen. Wenn alle Kommissionierung abgeschlossen ist spülen Sie die Bürsten und Schalen mit deionisiertem Wasser und setzen sich auf die Bank, um zu trocknen. Verschüttetes dass ereignet haben könnte, und wischen Sie das Innere des Q-Pix mit 80% Ethanol.

Teil 3: Nacht-Inkubation und Library-Speichersystemen

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Glycerin Lager Platten gekennzeichnet sind, und legen Sie sie in den 37 ° C Inkubator für 24 Stunden. Lassen Sie eine Notiz auf dem Inkubator, dass das Datum, Anzahl der Platten inkubiert, Inkubationszeit, die Zeit für die Entfernung und Ihre Initialen enthält.
  2. Für Langzeitlagerung, legen Sie die Nacht gezüchtet Inkubationen in einen -80 ° C Gefrierschrank.

Repräsentative Ergebnisse:

Das vorgestellte Protokoll beschreibt das Verfahren, wie eine ökologische Fosmid Bibliothek, um die genetische Inhalt einer mikrobiellen Gemeinschaft in einem bestimmten Lebensraum erfassen zu generieren. Dieses Protokoll sollte eine Fosmid Bibliothek, die Vertreter der genetischen Inhalt des beprobten Umwelt und sollten dem Leser ermöglichen, zu modifizieren und zu optimieren kritische Schritte, wenn die Menge der Fosmid Klone am Ende des gesamten Verfahrens erhalten ist zu niedrig.

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Discussion

Eine Prozedur ist beschrieben, wie man am effizientesten erzeugt eine große einsetzen Fosmid Bibliothek mit genomischer DNA aus einer Küstengewässer Probe abgeleitet. Up-stream genomischen DNA-Extraktion ist in einem gesonderten Protokoll [3] beschrieben.

Als Fosmid-Bibliothek Produktion ist ein mehrstufiger Prozess-, Plan mindestens zwei vor drei Wochen in der Zeit für das gesamte Verfahren einschließlich aller vier vorgestellten Schritte. Die Extraktion von genomischer DNA ist der wichtigste Schritt, und alle down-stream Schritte setzen auf die Qualität und Quantität der extrahierten genomischen DNA, so betrachten genug Zeit für diesen Schritt und arbeiten sorgfältig. Qualität und Quantität die Kontrolle über Ihre extrahierten DNA ist sehr wichtig. Es kann vorkommen, dass die Zahl der Fosmid Klone niedrig ist vor allem, wenn dies die erste Bibliothek wirst du machen. Als Fosmid Bibliothek Bau selbst ist straight forward, ist das Versagen vor allem durch eine mangelhafte Qualität und / oder Quantität Ihrer extrahiert und gereinigt genomische DNA verursacht. Betrachten Sie zum Extrahieren genomischer DNA und besonderes Augenmerk auf die Schritte in Reinigungs-und DNA-Recovery beteiligt, wenn Ihre Bibliothek Bau war nicht erfolgreich.

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Disclosures

Ich habe nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. MT und SL wurden von Stipendien von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Vielfalt und Evolution (CMDE) unterstützt. MT erhielt Stipendium von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
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Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

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