Stora Sätt Miljö Genomic Bibliotek Produktion

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Byggandet av en fosmid bibliotek med miljö-genomisk DNA isolerat från det vertikala djup kontinuum av en säsongsmässigt hypoxisk fjord beskrivs. Den resulterande klon biblioteket läggs i 384-brunnars plattor och arkiveras för nedströms sekvensering och funktionell screening genom tillämpning av ett automatiserat koloni plocksystem.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De allra flesta av mikrober i naturen förblir närvarande otillgänglig till traditionella odlingsmetoder. Under det senaste årtiondet, kultur-oberoende miljö-genomisk (

Protocol

Fosmid biblioteket Construction har delats in i fyra huvudsakliga steg och indelad i flera delar (se figur 1 för en översikt).

Steg I (se protokoll "DNA-extraktion från 0,22 mikroM Sterivex filter" [3])

Del 1: Enzyme-katalyseras cellslys

Del 2: Rening av miljö-DNA genom CsCl densitetsgradient centrifugering och DNA återhämtning

Del 3: Kvalitetskontroll av extraherat DNA med gelelektrofores

Steg II

Del 1: Enzymatisk modifiering steg av återvunnen miljö-DNA

Alla reagenser som behövs för slut-reparation steg på miljö-DNA ingår i pCC1 Fosmid biblioteket Produktion Kit från EPICENTRUM. Helst bör din genomiska DNA justeras till 0,5 mikrogram / l.

  1. Tina alla reagenser på is, kombinera följande och kort centrifugera röret för att få all vätska till botten:
    • x l sterilt vatten
    • 8 l 10X slutet reparation buffert
    • 8 l 2,5 mM dNTP mix
    • 8 l 10 mM ATP
    • upp till 20 mikrogram klippt in DNA (~ 0,5 mikrogram / l)
    • 4 l slutet reparation enzym blandning
    • 80 l totala reaktionen volym
  2. Inkubera vid rumstemperatur i minst 45 minuter upp till 60 minuter och värme inaktivera enzymet blandningen vid 70 ° C i 10 min (under tiden, förbereda en lågsmältande agarosgel för efterföljande storlek urval av end-reparerade DNA, se nedan).

Del 2: Storlek urval av arvsmassans DNA genom pulsade fält gelelektrofores (PFGE)

  1. Återsuspendera 1,5 g låg smältpunkt agaros i 150 ml 1,0 TAE löpande buffert och tillsätt en liten magnetisk omrörare. Täck kolven med mikrovågsugn plastfolie och koka snabbt i mikron tills agarosen är fullständigt upplöst. Rör lösningen tills det är tillräckligt kallt för att strömma in i gelen facket (~ 60 ° C).
    Observera: inkluderar inte etidiumbromid eller SYBR guld antingen i gel eller i löpande buffert.
  2. Montera gelen fack för att lägga din gel och välja en kam som ger dig tillräckligt med utrymme att lasta hela slutet reparation blanda i en eller två brunnar (80 l plus lämplig mängd av buffert).
  3. Häll 2,2 l 1,0 TAE i elektrofores kammare och slå på maskinen för att cirkulera löpande buffert och ställ in kylapparaten till 14 ° C. Pumpen bör köras på 70 rpm för att säkerställa tillräcklig cirkulation av löpande buffert och hålla bufferten på 14 ° C.
  4. Häll den smälta agarosen i gelen facket på en bra plan yta när den kyls ner och se till att du undvika bubblor. Se till att smälta agarosen är ännu på gelen kam, annars ta bort kammen och sätta tillbaka den i den smälta agarosen. När gelen stelnat, ta bort kammen och ladda ett mellanregister jag PFG markör i den fjärde väl av gelen. Extrude agarosen från gelen sprutan och skiva en liten plugg från slutet med en skalpell. Placera kontakten på framsidan av brunnen och täta med smält agaros. Placera gelen i elektrofores kammare.
    OBS: hantera dina agarosgel mycket noggrant så låg smältpunkt geler bromsar lätt. Kontrollera om löpande buffert har svalnat till 14 ° C innan du börjar ladda ditt gel. Om din brunnar ser blockerad av agaros, prova följande nästa gång: innan du tar bort kammen ur gelen, lägg 1-2 ml TAE-buffert runt kammen, vilket kommer att resultera i snyggare brunnar.
  5. I den första brunnen belastning 5 ìl av λ HindIII smälta följt av 1 ìl av fosmid kontroll storlek markör (EPICENTRUM, 100 ng / l). Tillsätt 10 l med sterilt vatten till storleken markör i ett mikrocentrifugrör samt en lämplig mängd av buffert. Den större volymen gör det enklare att lasta gelen. Direkt bredvid den fosmid markör ladda dina slutet repareras och värmeinaktiveras blanda med en lämplig mängd buffert. Stäng locket och programmera inställningar.
    Obs: vi verkligen rekommenderar fyller på olika mängder av andra DNA-stegar till ungefär kvantifiera mängden av DNA eller att visualisera omfattningen av klippning av din arvsmassans DNA. Perfekt storlek markörer är λ DNA-HindIII Digest och mellanregister jag PFG Marker (båda från NEB).
  6. Program inställningar: Använd Auto algoritm om ditt PFGE är utrustat med detta. Programmet beräknar automatiskt den inställning du behöver för att separera DNA av en viss storleksordning. Inställningar som används är: DNA storleksintervallet 2-250 Kb, kalibreringsfaktorn: 1, lutning: [6 V / cm] Speltid: 12:00 timmar, ingår vinkel: 120 °, inledande byta tid: 0,1 sek; sista tid för att byta : 21,79 sek; rampning faktor a = linjär.
  7. Att visualisera ditt DNA, häll 250 ml 1,0 TAE buffert i en behållare och tillsätt 25 ìl 10.000X SYBR Guld, blanda försiktigt innan du placerar din gel i lösningen. Fläckar på gel för 1 timme i mörker som SYBR Guld är ljuskänsligt.
    OBS: hantera dina engarose gel mycket noggrant så låg smältpunkt geler bromsar lätt.

Del 3: DNA-återhämtning genom gel-extraktion och ligation av återvunnen DNA till fosmid kloningsvektor

Alla reagenser för denna del ingår i Epicentrum fosmid-biblioteket produktion kit.

  1. Under tiden förbereder ett vattenbad vid 70 ° C och en vid 45 ° C för gelen matsmältningen steg.
  2. Ta dina färgade gelen tillsammans med en tom tarerad mikrocentrifugrör och en steril skalpell för att det blå ljuset transilluminator. Visualisera slutet reparerade arvsmassans DNA och fosmid kontroll storlek markör. Punktskatter en gel skiva med en skalpell som flyttade med och något över positionen för fosmid kontroll storlek markör (punktskatter en gel skiva som är 5-7 mm bred) och överför segmentet till tarerad mikrocentrifugrör. Kör ett mellanregister jag PFG markör på din gel eftersom detta hjälper dig att inte klippa gelen för hög.
    Obs: lägger plastfolie på det blå ljuset transilluminator innan du sätter din gel på den för att förhindra korskontaminering och slitage visning glasögonen innan du sätter på blått ljus. Inte punktskatter gel skivor där arvsmassans DNA är mindre än fosmid kontroll storlek markör eftersom detta kommer att resultera i oönskade chimär kloner.
    Du kan klippa ut och spara gel skivor som innehåller lägre eller högre molekylvikt DNA för att bygga hela genomet hagelgevär eller BAC bibliotek, respektive.
    Stoppa I: den återvunna gel slice (s) kan lagras vid -20 ° C i upp till ett år
  3. Väg tarerad rör och beräkna vikten av gelen slice (s). 1 mg agaros kommer att ge ca 1 l av smält agaros.
  4. Smält låg smältpunkt agarosen med ditt DNA i ett vattenbad vid 70 ° C i 10-15 minuter (vi vill inte lägga gelase buffert). Efter din gel slice är helt smält, överföra röret snabbt till 45 ° C.
    Observera: inte vortex ditt prov för att lösa eftersom det kan klippa ditt DNA.
  5. Tillsätt 1 U (1μl) av GELase enzympreparat per 100 l av smält agaros. Inkubera vid 45 ° C i 1 timme och sedan lägga till fler GELase (2-4 l) och inkubera under ytterligare en timme. Värm inaktivera GELase enzympreparatet vid 70 ° C i 10 minuter.
    Placera röret på is i 10 minuter och centrifugera röret vid maximalt varvtal (13.000 rpm) i 15 min till pellets några olösliga partiklar. Ta försiktigt bort den övre supernatanten och överför den till en 15 ml Falcon rör och tillsätt 3 ml sterilt vatten till röret.
    Obs: Undvik att pipettera något pelleterat agaros. När vi lägger till fler GELase än ingår i satsen, vi beställa extra GELase enzympreparat separat.
  6. Överför lösningen till ett Amicon Ultra-4 centrifugaltyp Filtersystem med Ultracel-10 membran och snurra röret vid 4000 g under 6-8 minuter och kasta passera. Centrifugera tills mängd lösning på filtret är reducerad till cirka 100 ~ 500 l. Lägg till ytterligare 3 ml sterilt vatten till den tomma Falcon röret från ovan och överför lösningen till Amicon röret och upprepa centrifugering steget. Tvätta en tredje gång med 3 ml vatten och släng flödet genom igen. Minska den slutliga volymen till 50 till 100 l.
    Observera: Vi använder en svängig hink rotor för centrifugeringssteget, helt enkelt placera Amicon centrifugala filtret in till en 50 ml Falcon rör för att hålla den på plats under centrifugering. Amicon filtret behåller säkert 50 ìl av lösningen på filtret även efter förlängd centrifugering.
  7. Överför kvarvarande DNA lösningen ur Amicon röret i ett förtvättad Microcon YM-50 Centrifugal filterenhet och skölj Amicon röret med ytterligare 50 ìl av sterilt vatten för att återställa alla DNA. Centrifugera Microcon YM-50 Radialfläkt filterenhet i mikrocentrifug vid 10000 g tills filtret är fortfarande lite täckt av vätska. Kontrollera varje minut om endast en liten mängd vätska kvar på filtret. Vänd filtret upp och ner och återställa DNA-lösning av en andra centrifugering steg vid 1000 g under 3 min i en fräsch mikrocentrifugrör. Den resulterande volymen bör inte överstiga 10-15 l totalt, annars ditt DNA kan vara för utspädd i ligering steg.
    Obs: Var noga med att inte snurra ditt filter enhet till fullständig torrhet. Om din membran är torr, tillsätt sedan 10-15 l vatten på membranet, agitera försiktigt i 30 sekunder och återställa ditt DNA som beskrivits ovan.
  8. Kvantifiera dina resultat DNA-lösning genom NanoDrop eller PicoGreen analys.
  9. Återvunna slutet repareras DNA är nu redo att knyts ihop till pCC1-fosmid kloningsvektor. Tina följande lösning på is och se vektorn att sätta molförhållandet är 10:01.
    OBS: 0,5 mikrogram pCC1-fosmid vektor ~ 0,09 pmoles vektor.
    0,25 mikrogram på ~ 40 Kb in DNA ~ 0,009 pmoles in DNA
    Öka mängden av DNA som används i ligation steg kan vara till hjälp om du skulle få bara ett par fosmid kloner efter plätering infekterade E. coli-cellerVal plattor.

    Tillsätt reagens i den ordning nedan och kortfattat centrifugera röret för att få all vätska till botten, tryck på tuben och snurra igen:

    • x l sterilt vatten
    • 1 l 10X Snabb-Link ligering buffert
    • 1 l 10 mM ATP
    • 1 l pCC1-fosmid vektor (0,5 mikrogram / l)
    • x l koncentrerad in DNA (0,25 mikrogram)
    • 1 l Snabb-Link DNA-ligas
    • 10 l totala reaktionen volym
  10. Inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar och värme inaktivera enzymet i 10 minuter vid 70 ° C.
    Stop II: lagra ligation blandning vid -20 ° C eller gå vidare till fag förpackningen steg.
    Observera: En enda ligation reaktion kommer att producera 10 3 -10 6 kloner beroende på kvaliteten av de miljömässiga DNA. Baserat på det uppskattade antalet kloner som krävs för viss täckning, kan du skala upp ligering reaktionen. Om ligatur skalas upp, då mängden phage förpackningar extrakt bör ökas därför enligt beskrivningen nedan.

Steg III

Del 1: Phage-förpackning av vektor-in ligering produkt

  1. Två eller tre dagar innan avsedd fag förpackning strimma ut som EPI300-T1 R bordläggning påfrestningar på en slätt LB plattan och inkubera över natten vid 37 ° C för att få enstaka kolonier. Denna platta kan förseglas och förvaras vid 4 ° C för framtida bruk.
  2. Dagen innan förpackningen reaktionen inokulera 50 ml LB buljong + 10 mm MgSO 4 (lägga 500 l 1M MgSO 4) med en enda koloni av plattan som genereras i steg 1. Skaka på 225 rpm och 37 ° C över natten.
  3. Dagen av förpackningen reaktioner inokulera färska 50 ml LB-buljong + 10 mm MgSO 4 med 5 ml av den natten kulturen bereddes i steg 2. Växer vid 37 ° C till en OD 600 på 0,8 till 1,0 och inte överstiga OD 600 på 1,0! Späd ditt prov före mätning på spektrofotometern så att du får ett korrekt resultat. Förvara cellerna på is eller vid 4 ° C tills vidare användas.
    OBS: Stoppa III: kultur kan förvaras vid 4 ° C i upp till 72 timmen om det är nödvändigt, men med hjälp av en ny växt upp kulturen rekommenderas starkt.
  4. Tina, på is, genomförde MaxPlax Lambda Packaging Extrakter, 1 tub för varje ligation reaktion som tidigare. Upptining kommer att ta 10-15 minuter. Samtidigt placera 1,5 ml rör på is som ska pre-kyld.
    Obs: Lämna inte tinade fag på isen för länge. Annars phage infektion effektivitet kommer att minska.
  5. När tinade genast över 25 l på varje förpackning som extrakt en andra pre-kylda 1,5 ml mikrofugrör och lägg på is. Återgå kvarvarande förpackningar extrakt till - 80 ° C.
    Obs: Förvara inte förpackningen extraktet med torris eller någon annan CO 2 källa.
  6. Tillsätt 10 ìl av ligering reaktion på varje 25 ìl av tinas extrakt på is. Blanda genom att pipettera lösningen flera gånger, undvika att införa luftbubblor. Kortfattat Centrifugera rören för att få all vätska till botten av röret och inkubera förpackningen reaktioner vid 30 ° C i 90 min. Efter 80 min av inkubationstiden tina kvarvarande förpackningar extrakt på is.
    Obs: använd ett vattenbad istället värmeblocket för 30 ° C inkubering steg.
  7. Efter 90 min förpackning reaktionen är klar tillsätt resterande 25 l förpackningar extrakt till varje reaktionsrör. Inkubera reaktioner för ytterligare 90 minuter vid 30 ° C. Efter 90 minuter inkubation tillsätt 100 l av det beredda Phage spädningsbuffert i varje förpackning röret och blanda försiktigt.
    OBS: Om din effektivitet bör vara låg i slutet, kan din fag extrakt vara för gamla eller har varit utsatta för torris eller någon annan CO 2 källa. Vår erfarenhet är fag förpackning vid rumstemperatur (2 gånger 90 min) i stället för 30 ° C följt av en slutlig ytterligare inkubation i 2 timmar vid 30 ° C ökade mängden resulterande kloner.
  8. Tillsätt 5 l kloroform till varje rör och blanda försiktigt resulterar i en total volym på 165 l i röret. Ett visköst fällning kan bildas efter kloroform Dessutom, det kommer inte störa bibliotekets produktion. Men att undvika denna fälla, liksom den organiska kloroformfasen vid pipettering av fag partiklar.
    Stopp IV: Vid denna punkt förpackade fag partiklar kan lagras i flera dagar vid 4 ° C.
    Obs: för bästa fag infektionen effektivitet, använd färska förpackade fag.

Del 2: Infektion av biblioteket värd E. coli

  1. Lägg förpackade phage till EPI300-T1 R värdceller (OD 600 = 0,8-1,0) i förhållandet 400 ìl EPI300-T1 R celler för varje 10 ìl fag partiklar. För att undvika pipettering all kloroform vi använder 125 ìl av förpackade fag partiklar och 5 ml beredd EPI300-T1 R värdceller. Blanda försiktigt och sedan inkuberas vid 37 ° C i 30 min.
    Obs: Var noga med att inte överföra kloroform till värdceller när du tar bort phage partikel från fag förpackningen röret. Om du är osäker, ta mindre av den paketerade fag partiklar.

Del 3: Plätering och titering

  1. Lägg 5-7 steriliserade glaspärlor på fyra små LB + 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol petriskålar.
  2. Sprid två gånger 50 l och två gånger 10 ìl av phage infekterade EPI300-T1 R celler på fyra separata plattor. För att säkerställa en jämn spridning, lägga till några LB buljong (~ 50 l) på plattorna med 10 ìl fag infekterade celler. Skaka plattan horisontellt för att jämnt sprida ut cellerna på tallriken. Låt plattan torka i 15 min och sedan ta bort kulorna genom att vända plattan.
    Obs: dessa plattor används för att bestämma antalet transformants och för att beräkna lämplig spädningar som krävs i kolonin plocka steg för att undvika en alltför stor koloni densitet.
  3. Placera plattorna upp och ned i en 37 ° C inkubator för 16 till 24 timmar upp till 48 timmar tills kolonier form. Kontrollera plattorna efter 24 timmar för att förhindra snabbväxande kloner att växa till grannen kolonier.
  4. Samtidigt skörd kvarvarande cellerna överblivna från 5 ml smittan genom centrifugering vid 3500 g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Tillsätt 1 ml LB / 20% glycerol till röret. Återuppslamma cellpelleten och alikvot det till 100 l vardera i 2 ml cryovial rör. Frys omedelbart och förvaras vid -80 ° C för vidare användning i kolonin plocka steg.
  5. Nästa dag, räkna antalet kloner på plattorna och bestämma titer. Se till att den korrekta spädningsfaktorn för att beräkna den totala mängden fosmid-kloner.
    Obs: denna procedur genererar mellan 10.000 och 50.000 fosmid-kloner i totalt, men beroende på kvalitet och renhet för det extraherade miljö-DNA, ett intervall mellan 3.000 upp till 80.000 fosmid kloner observeras.

Steg IV

Del 1: Agar-och väl plattor förberedelser

  1. Häll material i plattorna enligt följande; inkluderar 12,5 mikrogram kloramfenikol per ml LB:
    • 100X15mm petriskål: 25 ml LB agar
    • 150X15mm petriskål: 50ml LB agar
    • 245X245mm torget bioassay skylt: 250ml LB agar
    OBS: Det är viktigt att hälla media på ett bra plan yta för att göra djup av agar jämnt över plattan. Vi rekommenderar 245X245 mm plattor för fosmid bibliotek så att du slipper hantera många plattor.
  2. Tina din glycerol lager som innehåller den förberedda fosmid kloner på is. Sprid beloppet lämpliga för plattan som du vill använda baserat på din beräknade titer (förbereda glycerol beståndet dessutom koncentrerar dina celler ~ 5 gånger). Inkubationstiden för celltillväxt är 24 timmar vid 37 ° C.
    Stoppa V: när kolonier bildas, förvara förseglade agarplattor vid 4 ° C i upp till en månad tills de används i kolonin plocka steg.
    Obs: kolonier måste spridas ut jämnt, ligger tillräckligt långt från varandra och bör växa ungefär 1 mm i diameter. Plätering celler med hjälp av glaspärlor kan generera en god separation mellan kolonier. På en 100X15mm petriskål, ~ vanligtvis 150 250 kolonier är en bra täthet för högsta robot plocka effektivitet och för 22 x 22 cm, bör inte mer än 2000 kolonier erhållas.
  3. På dagarna av kolonin plocka, förbereda 96 eller 384 brunnar fyllda med LB buljong kompletteras med 12,5 mikrogram kloramfenikol per ml buljong samt 20% glycerol för biblioteket förvaring vid -80 ° C. Brunnar är fyllda med det automatiska QFill3 tallriken fylls systemet som beskrivs nedan.
  4. Autoklav 2 uppsättningar glasflaskor (500 ml), lock och silikonslang. Får inte autoklaveras grenrör, inklusive nål montering och flänsen. Montera QFill3 nära en Bunsenbrännare låga eller inom en huva för att skapa och behålla en steril miljö.
    Obs: Se till att silikonslang sätts in i klämventil genom att trycka på aktivator slangventil och skjuta slangen helt i ventilen. (Detta fungerar som en broms för att skipa medium till nästa kolumn).
  5. Sterilisera doseringsnålar genom att passera ~ 50 ml 1% blekmedel, autoklaveras dH 2 O och 80% etanol, en i taget och placera ett lock spets låda på plattformen för att samla in avfall lösningar. Efter sterilisering, byt till den andra bestående av flaska, lock och kisel slangen.
  6. Fyll flaskan med ~ 300 ml medium. Kör nog medium genom att få bort eventuell kvarvarande etanol från rening steg. När slangen är rengjord, ladda ett 96/384 brunnar på plattformen. Tryck på "Start" för att fylla din tallrik, varje brunn bör fyllas med 200 l av beredda LB buljong. För att rengöra doseringsnålar, kör ~ 50 ml 80% etanol igenom.
    OBS: Se till att din brunnar är märkt innan de fylls.

Del 2: koloni plockrobot installation

  1. Vi använder klon plockrobot QPix2 ACligt för användaren handbok. Användarna bör känna hantera sin robot och hur du ställer in allt för att garantera högsta plocka effektivitet.
  2. För att skapa en steril miljö runt klon plocka området, slå på UV-ljus i 30 minuter. Medan UV-ljuset är på, förbereda 500 ml 1% blekmedel, 500 ml steril dH 2 O och 500 ml 80% etanol. När UV-ljuset stänger fylla upp brickor som märkt. Alltid Häll lösningarna i korrekt märkta lösningen brickor. Från bakfram fylla i 1% blekmedel, sedan autoklaveras dH 2 O, och 80% etanol i främre facket. Se till att de är fulla. Plocka nålar kan inte tvättas ordentligt utan tillräckligt tvättlösning.
    Obs: kontrollera 80% etanol över tiden. Det kommer att avdunsta och måste fyllas på.
  3. När du har ställt in parametrarna för optimal plockning, placera beredd agarplattor med fosmid kloner och brunnar mellan stolparna i Q-Pix arbetsområde. Se till att du har tagit alla plåten täcker off!
  4. Plattor ska vara tätt mot främre högra hörnet, så det inte kan röra sig under plockning. Stäng sedan frontpanelen.
    OBS: Detta är oerhört viktigt!
  5. När alla parametrar är inställda på att plocka proceduren kan börja. När alla plockning är klar skölj borstar och brickor med avjoniserat vatten och ställ på bänken för att torka. Städa upp spill som kan ha inträffat, och torka av insidan av Q-Pix med 80% etanol.

Del 3: Övernattning inkubation och bibliotek lagring

  1. Se till att alla glycerol lager plattor är märkta, och placera dem i 37 ° C inkubator i 24 timmar. Lämna en lapp på inkubator som innehåller datum, antal plattor inkuberas, tid för inkubation, tid för borttagning och dina initialer.
  2. För lång tid förvaring, placera vuxit över natten inkubationer i en -80 ° C frys.

Representativa resultat:

De presenterade protokoll beskrivs det förfarande hur man skapar en miljö fosmid bibliotek för att fånga den genetiska innehållet i en mikrobiella i en given livsmiljö. Detta protokoll bör skapa en fosmid bibliotek som är representativt för den genetiska innehållet i de utvalda miljön och bör göra det möjligt för läsaren att modifiera och optimera kritiska steg om mängden fosmid kloner som erhållits i slutet av hela förfarandet är för låg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En procedur beskrivs hur man mest effektivt generera en stor Sätt fosmid bibliotek med genomiska DNA från ett kustnära vattenprov. Uppströms genomiska DNA-extraktion beskrivs i ett särskilt protokoll [3].

Som fosmid-biblioteket produktion är en flerstegsprocess-process, planera minst två till tre veckor i tiden för hela förfarandet inklusive alla fyra som presenteras steg. Utvinning av arvsmassans DNA är det mest avgörande steget och alla nedströms steg lita på kvalitet och kvantitet extraherade arvsmassans DNA, så anser tillbringa tillräckligt med tid för detta steg och arbete noggrant. Kvalitet och kvantitet kontroll över din extraherat DNA är mycket viktigt. Det kan hända att antalet fosmid kloner är låg, särskilt om det är första bibliotek du ska göra. Som fosmid biblioteket konstruktionen i sig är rakt fram, är fel orsakas främst av otillräcklig kvalitet och / eller kvantitet av dina utvinns och renas genomiska DNA. Tänk på att packa genomiska DNA och ägna särskild uppmärksamhet åt de olika stegen i renings-och DNA-återvinning om ditt bibliotek konstruktion var inte lyckat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jag har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och Statens Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada för att stödja pågående studier på låg syre regioner i kustnära och öppna hav vatten. MT och SL fick stöd av stipendier från Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution (CMDE). MT fick också gemenskap stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics