एक डिब्बे मल्टी सीएनएस न्यूरॉन - सह - संस्कृति glia Microfluidic प्लेटफार्म

Biology

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Summary

हम इन विट्रो सीएनएस बातचीत अक्षतंतु glia अनुसंधान में के लिए एक उपन्यास बहु - डिब्बे न्यूरॉन सह संस्कृति माइक्रोसिस्टम मंच विकसित की है. मंच समानांतर में छह स्वतंत्र प्रयोगों का आयोजन करने में सक्षम है और एक नव विकसित / मैक्रो सूक्ष्म संकर निर्माण विधि का उपयोग कर गढ़े.

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Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (31), e1399, doi:10.3791/1399 (2009).

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Abstract

Protocol

भाग 1: बहु डिब्बे के लिए एक मास्टर मोल्ड तैयारी न्यूरॉन उपकरण निर्माण सह संस्कृति

  1. PMMA मास्टर बनाना पहले कदम के लिए 3.5 मिमी गहरी डिब्बों बनाना है. एक सोम डिब्बे और छह अक्षतंतु / glia डिब्बों एक PMMA एक सूक्ष्म मिलिंग मशीन (MDX-40, रोलाण्ड या किसी भी अन्य सीएनसी मिलिंग मशीन) का उपयोग कर ब्लॉक पर परिभाषित कर रहे हैं. PMMA मास्टर फिर 10 मिनट मलबे को हटाने के लिए है isopropyl शराब में sonicated.
  2. 2.5 सुक्ष्ममापी उच्च रिज संरचनाओं के Arrays एक मानक photolithography प्रक्रिया द्वारा एक 50.8 x 50.8 मिमी गिलास स्लाइड मिमी, कांच के गीला नक़्क़ाशी द्वारा पीछा किया पर नमूनों हैं.
    सबसे पहले, रिज संरचनाओं की सरणी सकारात्मक photoresist S1818 के साथ एक साफ कांच सब्सट्रेट photolithography का उपयोग नमूनों पर हैं. S1818 (4000 rpm) सब्सट्रेट, 110 पर आधारित नरम पर स्पिन - लेपित ° 5 मिनट के लिए सी, और तब यूवी प्रकाश (MJ 84 / 2 सेमी) 40 के लिए एक मुखौटा MF319 में photoresist के विकास के द्वारा पीछा किया aligner का उपयोग करने के लिए उजागर सेकंड. अगला, photoresist नमूनों गिलास सब्सट्रेट बफर खोदना ऑक्साइड (BOE) में कमरे के तापमान पर डूब जाता है 6-7 मिनट के लिए एक 2.5 सुक्ष्ममापी लंबा रिज संरचनाओं प्राप्त है. अंत में, photoresist परत एसीटोन और isopropyl शराब के द्वारा हटा दिया जाता है, de-ionized पानी (डीआई) में पूरी तरह से rinsing द्वारा पीछा किया.
  3. सूक्ष्म रिज संरचनाओं के साथ ग्लास सब्सट्रेट PMMA करने के लिए अपने पैटर्न हस्तांतरण मास्टर के खिलाफ गर्म उभरा है.
    सबसे पहले, PMMA मोल्ड मास्टर और ग्लास substrates मैन्युअल रूप से और जुड़ रहे हैं एक गर्म प्रेस पर रखा. फिर, तापमान 115 के लिए उठाया है डिग्री सेल्सियस एक बार वांछित तापमान तक पहुँच है, 0.5 टन वजन के 5 मिनट के लिए लागू किया जाता है. 5 मिनट के बाद, तापमान 40 डिग्री सेल्सियस और दबाव जारी है ठंडा करने के लिए है. PMMA मास्टर तो एक 50.8 मिमी x 50.8 मिमी आकार ब्लॉक में कटौती है.
  4. वजन द्वारा 1: पूर्व बहुलक PDMS (184 Sylgard) 10 के अनुपात में इलाज के एजेंट के साथ मिलाया जाता है.
  5. PMMA मास्टर एक पीपा और PDMS मिश्रण PMMA मास्टर के शीर्ष पर डाल दिया है के लिए एक PDMS मास्टर बनाना अंदर रखा है. यह तो एक एक वैक्यूम पंप से जुड़ा desiccator में रखा गया है. PDMS PMMA मास्टर के शीर्ष पर डाला है तो 15 मिनट के लिए degassed PDMS मिश्रण प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न बुलबुले को दूर.
  6. जब सभी बुलबुले हटा रहे हैं, PDMS एक समतल 85 डिग्री सेल्सियस ओवन के अंदर polymerization के लिए एक घंटे के लिए डाल दिया है.
  7. एक बार PDMS पूरी तरह से ठीक हो जाता है, PDMS मास्टर बंद PMMA मास्टर से खुली है और trichlorosilane की 2-3 बूंदों के साथ एक desiccator अंदर रखा और वाष्प कोट से 15 मिनट PDMS मास्टर सतह के लिए vacuumed. Trichlorosilane कोटिंग अंतिम PDMS मास्टर से PDMS न्यूरॉन सह संस्कृति उपकरणों की रिहाई की सुविधा. कोटिंग के बाद, PDMS मास्टर संक्षिप्त isopropyl शराब के साथ rinsed है अत्यधिक trichlorosilane हटाने, और एन 2 गैस के साथ सूख.

भाग 2: न्यूरॉन संस्कृति डिवाइस प्रतिकृति

  1. वजन द्वारा 1: पूर्व बहुलक PDMS (184 Sylgard) 10 के अनुपात में इलाज के एजेंट के साथ मिलाया जाता है.
  2. PDMS मिश्रण PDMS मास्टर के शीर्ष पर डाल दिया है और एक 15 मिनट के लिए एक वैक्यूम पंप से जुड़ा desiccator अंदर degassed. यह महत्वपूर्ण है बहुत ज्यादा नहीं PDMS डाल इतना है कि मास्टर पर 3.5 मिमी उच्च PDMS संरचना पूरी तरह नहीं डूब जाता है.
  3. जब सभी बुलबुले हटा रहे हैं, PDMS एक समतल 85 डिग्री सेल्सियस ओवन के अंदर polymerization के लिए एक घंटे के लिए डाल दिया है.
  4. PDMS ओवन से बाहर ले लिया है एक घंटे के बाद और शांत कमरे के तापमान पर छोड़ दिया. फिर, PDMS न्यूरॉन संस्कृति उपकरणों धीरे PDMS मास्टर से कर रहे हैं से खुली. PDMS उपकरणों बंद खुली parafilm के साथ लिपटे रहे हैं उन्हें धूल या मलबे से बचाने के.
  5. PDMS उपकरणों, parafilm के साथ लिपटे, व्यक्ति एक ड्रिल एक ब्लेड के साथ सुसज्जित प्रेस का उपयोग टुकड़ों में काट रहे हैं.

भाग 3: डिवाइस विधानसभा

  1. PDMS न्यूरॉन संस्कृति डिवाइस प्लाज्मा क्लीनर के अंदर रखा गया है और 90 सेकंड के लिए हवा प्लाज्मा उजागर PDMS डिवाइस की सतह हाइड्रोफिलिक बनाने. यह प्लाज्मा उपचार पाली - घ lysine लेपित सब्सट्रेट करने के लिए एसेंबली के बाद संस्कृति मीडिया के साथ भरा होना microchannels सुविधा होगी.
  2. प्लाज्मा के साथ इलाज डिवाइसेज तो नसबंदी के लिए 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डूबे और निष्फल जैव - हुड के अंदर चले गए.
  3. निष्फल उपकरणों 70% इथेनॉल से बाहर ले रहे हैं और Millipore फ़िल्टर एन 2 गैस के साथ सूख . सूखे उपकरणों पाली - घ - lysine लेपित polystyrene के शीर्ष पर रखा जाता है 6-अच्छी तरह से संस्कृति की थाली और कोमल दबाव सब्सट्रेट और डिवाइस के बीच सील सुनिश्चित करने के लिए लागू किया जाता है.
  4. संस्कृति मीडिया तब सोम डिब्बे में भरा है, छह अक्षतंतु / glia डिब्बों भरने के द्वारा पीछा किया. सोम डिब्बे संस्कृति मीडिया को जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले microchannels के अंदर फंस रहे हैं के बाद अक्षतंतु / glia डिब्बों भरने से पहले 1-2 मिनट थामने देना बेहतर है.
  5. संस्कृति मीडिया के साथ भरा डिवाइसेज एक डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए किसी भी संभावित मलबे या विषाक्त अवशेषों कुल्ला रातोंरात 37 के अंदर incubated है.

भाग 4सेल लोड हो रहा है और न्यूरॉन oligodendrocyte सह संस्कृति

  1. सेल संस्कृति के पहले दिन पर, भ्रूण दिन से प्राथमिक अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन कोशिकाओं 16-18 चूहों कोशिकाओं 500 / 2 मिमी की एक areal घनत्व में सोम डिब्बे में लोड कर रहे हैं. सबसे पहले, दोनों सोम डिब्बे और अक्षतंतु / glia डिब्बों के अंदर संस्कृति मीडिया विंदुक सेल लोड हो रहा से पहले से aspirated का उपयोग कर रहे हैं. फिर, 38500 कोशिकाओं, संस्कृति मीडिया के 40 μl में पतला, microchannel inlets के आसपास सोम डिब्बे में लोड कर रहे हैं. यह महत्वपूर्ण है PDMS डिवाइस छू नहीं है, जबकि कोशिकाओं लोड हो रहा है, क्योंकि यह डिवाइस और सब्सट्रेट के बीच सील तोड़ कर सकते हैं.
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर 30 मिनट के लिए सेल लोड उपकरणों सेते सब्सट्रेट करने के लिए कोशिका आसंजन बढ़ाने के लिए. ऊष्मायन के बाद, सभी डिब्बों संस्कृति मीडिया के साथ भर रहे हैं.
  3. कक्ष 37 में संवर्धित कर रहे हैं · humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी और संस्कृति मीडिया के केवल आधे हर 3-4 दिनों बदल गया है.
  4. इन विट्रो में न्यूरॉन संस्कृति के 14 दिनों के बाद, oligodendrocytes सह संस्कृति के लिए / अक्षतंतु glia डिब्बों के लिए जोड़ रहे हैं. Oligodendrocytes, प्रसव के बाद 1-2 दिन में Sprague Dawley चूहों के मस्तिष्क गोलार्द्धों से dissected, 1000 कोशिकाओं / 2 मिमी के एक क्षेत्र घनत्व प्रत्येक डिब्बे / अक्षतंतु glia जोड़ रहे हैं. लोड हो रहा है कोशिकाओं से पहले डिब्बों के अंदर संस्कृति मीडिया का लगभग 60% विंदुक के साथ से aspirated हैं. सावधानी नीचे सब्सट्रेट स्पर्श नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह axonal सब्सट्रेट पर गठित नेटवर्क को नुकसान पहुंचा सकता है. फिर, 6700 oligodendrocyte कोशिकाओं, संस्कृति मीडिया के 5 μl में पतला, अक्षतंतु / glia डिब्बों के लिए जोड़ रहे हैं. कक्ष 1 घंटे के लिए incubated रहे हैं और डिब्बों संस्कृति मीडिया के साथ भर रहे हैं.
  5. कक्ष 37 में संवर्धित कर रहे हैं ° सी humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर और संस्कृति मीडिया के केवल आधे बाहर बदल दो सप्ताह के लिए हर 3-4 दिनों में.

भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:

जब प्रयोगों बाहर किया जाता है ठीक से, न्यूरॉन सोम डिब्बे के लिए लोड कोशिकाओं पता लगाने microchannel inlets और axonal परत करने के लिए करीब संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद अक्षतंतु / glia डिब्बों के अंदर फार्म शुरू. साइन इन सोम डिब्बे के अंदर न्यूरॉन सेल एकत्रीकरण की एक संकेत है कि कोशिकाओं को स्वस्थ नहीं हैं किया जा सकता है. जब न्यूरॉन संस्कृति के दो सप्ताह बाद oligodendrocytes लोड हो रहा है, अक्षतंतु / glia डिब्बों axons और oligodendrocytes के घने परत के साथ कवर किया जाना चाहिए axonal परत के शीर्ष पर लोड किया जाना चाहिए.

1 आंकड़ा
चित्रा 1 उच्च throughput microfluidic डिब्बे बहु सीएनएस न्यूरॉन सह संस्कृति मंच के योजनाबद्ध चित्र. क्रॉस अनुभागीय दृश्य neuronal सोम और dendrites के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मिनट fluidic स्तर के अंतर के साथ डिब्बों के बीच fluidic अलगाव से axons की अलगाव दिखा. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 2
चित्रा 2. निर्माण और बहु डिब्बे के लिए विधानसभा कदम PDMS microfluidic युक्ति सह संस्कृति. प्रत्येक डिवाइस में फिट बैठता है अच्छी तरह से एक पारंपरिक 6 अच्छी तरह से योग्य polystyrene सेल संस्कृति प्लेट के एक है. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

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Discussion

हम स्तनधारी सीएनएस अक्षतंतु - glia बातचीत के अध्ययन के लिए एक बहु डिब्बे सह संस्कृति मंच विकसित किया है. सीएनएस axons सफलतापूर्वक neuronal सेल निकायों / dendrites से अलग थे, और oligodendrocytes सफलतापूर्वक थे डिवाइस के अंदर सह सुसंस्कृत. न्यूरॉन घनत्व अनुप्रयोगों द्वारा अलग किया जा सकता है, लेकिन बहुत कम या बहुत उच्च एकाग्रता कोशिकाओं को मरने के लिए पैदा कर सकता है. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है संस्कृति मीडिया के केवल आधा ताकि सब्सट्रेट पर कोशिकाओं या axonal परत क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं बदलने. हमें उम्मीद है कि इस प्रणाली अक्षतंतु glia इन विट्रो में संकेतन नेटवर्क सीएनएस के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है और उच्च throughput स्क्रीनिंग वृद्धि कारक या संभावित उम्मीदवारों दवा है कि myelination और myelin की मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए एक मंच की ओर एक रास्ता प्रदान करेंगे.

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Acknowledgements

यह काम स्वास्थ्य / मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH / NIMH) के राष्ट्रीय संस्थानों 1R21MH085267 # अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

References

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  2. Xia, Y., Whitesides, G. Soft Lithography. Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).
  3. Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
  4. Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).

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