文化和维护人类胚胎干细胞

Biology
 

Summary

此协议表明如何保持健康,未分化的人类胚胎干细胞(ES)。

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Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells . J. Vis. Exp. (34), e1427, doi:10.3791/1427 (2009).

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Abstract

人类胚胎干细胞(HES),必须监测和照顾,为了保持健康,未分化的文化。最低限度,必须美联储文化,每天执行一个完整的介质的变化,以补充丢失的营养物质和保持文化不必要的分化因子。虽然少量的分化是正常的,预计在干细胞培养,文化应定期清理手动删除,或“捡”有区别的地区。查明和消除多余的胚胎干细胞培养分化,是在维护一个健康的细胞人口的基本技术。

Protocol

1。维护:在显微镜下观察文化

  1. 从37℃培养箱中取出胚胎干细胞的板和带来的显微镜。
  2. 注意在低功率的殖民地,使用2倍或5倍的放大倍率,以评估整体文化素质。请注意以下几点:中等颜色正常,没有任何可见的污染,整个聚落的大小,质量和密度,以及任何其他意见。
  3. 观察中的颜色变化。由于在pH值的变化和孵育过夜后,与胚胎干细胞的培养基中的营养物质耗尽,介质会改变一个红色的“救命稻草”的色彩。如果中期出现紫色的,一个基本的pH值变化已经发生。如果介质出现极其黄色,中型酸化。很黄介质可能会非常拥挤的殖民地井或污染的结果。媒介应该出现在任何时候都清楚的。虽然在中期的细胞碎片一定程度是正常的,它不应该出现浑浊。如果观察到一个高水平的细胞碎片,文化健康及可能被污染。
  4. 如果文化不要求维修或传代,他们可以采取的生物安全柜,美联储(见第2节)。
  5. 如果文化中含有约10%,区分菌落多,细胞应该是“清理”手动删除有区别的地区(见第3节)。
  6. 如果文化包含大或密集的殖民地,或MEF饲养层超过12天,应传代细胞(见第4节)。

2。进料胚胎干细胞

  1. 在无菌的生物安全柜,取出培养皿的盖子,并吸出花了中等。不要让吸管尖碰板直接内水井以外的任何部分。如果有任何的污染问题,改变到一个新的,无菌的吸管。
  2. 使用无菌玻璃吸管,回暖的胚胎干细胞培养液中添加适量的每口井。对于在6孔板文化,每孔加入2.5毫升培养基。
  3. 返回板的孵化器,以保持在37 ° C和5%的CO 2 。

3。删除从胚胎干细胞培养分化

  1. 采摘工具转换成9英寸的玻璃巴斯德吸管成型控制在酒精灯火焰的提示。可以肯定的吸管尖密封,以防止污染和圆角,避免划伤塑料培养皿。消毒前使用生物安全柜在使用紫外线光源,或采摘外壳采摘工具。
  2. 删除有区别的地区。分化往往发生在一个胚胎干细胞集落,通常沿着边缘或中心隔离点,只有一部分。如果只有一个殖民地的部分是区分的,只有差异化方面的需求被删除。分化往往可以解除“粘”表板,它是有帮助的首次单独从殖民地的其余部分分化的细胞,由殖民地通过绘制一条线,采摘工具。
  3. 一旦殖民地的部分分离出来,轻轻地沿板滑行采摘工具,以分离不需要的细胞。小心不刮走太多的MEF饲养层之间在这一进程中的殖民地。
  4. 当分化的细胞都是从板(和浮在中期)删除,回归文化的生物安全柜。吸分化细胞的培养基中含有与新鲜胚胎干细胞培养液更换。

4。传代胚胎干细胞

酶孵化

  1. 在无菌的生物安全柜,取出的6孔培养皿的盖子,并从代井吸花的介质。不要让吸管尖碰板直接内水井以外的任何部分。
  2. 使用无菌玻璃吸管,添加1毫升回暖胶原酶以及每个要传。
  3. 5分钟,37℃孵化器返回板块。

刮池的胚胎干细胞

  1. 在培育的细胞胶原酶,在显微镜下观察的殖民地。这种酶,应引起一个微妙而明显的变化,在殖民地边缘。
  2. 在生物安全柜,轻轻吸出每口井的酶和取代2.0毫升胚胎干细胞培养液中。
  3. 提示稍对你的培养板,并用5毫升的玻璃吸管取2.0毫升培养基中的第一口井。拿着吸管垂直板底部,轻轻地滑过整个以及吸管尖,一边慢慢释放介质。
  4. 重复的拼抢和pipetti议员的议案3-4次,直到所有的殖民地已被调离井。吸取轻轻避免太小件分解成殖民地。当细胞从第一口井已被删除,留下的内容,并在井开始刮的未来以及细胞。
  5. 当所有要传的井已被刮掉,池的培养基中含有从每口井在无菌的15 mL锥形管的殖民地件。
  6. 胚胎干细胞培养液中加入1毫升每口井的冲洗刮井。收藏本冲洗,并转移到锥形管。
  7. 吸取的细胞轻轻地在管分手殖民地件所需的大小。
  8. 5分钟后,细胞离心200 × G.

电镀胚胎干细胞的细胞

  1. 虽然胚胎干细胞在离心机,准备一个新的6 MEF馈线板。标签:细胞系与适当的胚胎干细胞的信息板,新的通道数量,并通过日期。从水井吸的MEF介质,每孔加入1.0毫升的PBS。轻轻旋流井周围的缓冲区和吸出PBS冲洗。加入1.5 mL的胚胎干细胞培养液中,每孔和预留设置的板块。
  2. 当胚胎干细胞完成离心,使管的生物安全柜。吸出上清液,小心不要去打扰松散包装的细胞沉淀。
  3. 颗粒细胞重悬于1毫升胚胎干细胞培养液中,每孔镀足够的介质。当分裂成6口新井,6毫升培养基中的颗粒悬浮。
  4. 1毫升细胞悬液,轻轻地,均匀地添加到每个准备MEF馈线板。
  5. 放置到37℃孵化器板,小心地将板着回来,方方,均匀地分布在整个以及细胞。
  6. 允许细胞附加在37 ° C过夜。

5。代表性的成果:

未分化的胚胎干细胞是小的,紧密包装,通常包括更大,更出细胞扩散。在殖民地(图1A)或殖民地(图3B)之间的分化可能会发生。

在低倍率显微镜下下可以看到不同的morhopologies。在图2a可见,一个良好的细胞形态,包含小,单层生长的细胞排列紧密。细胞应该具有清洁,定义的边缘,几乎没有差异。在图2b所示的细胞传代,都是人满为患,在图2C所示的细胞。

图1
图1。分化的胚胎干文化 (一)(二)分化殖民地之间的殖民地的分化。

图2
图2。在hES文化形貌看到 。 (一)(二)良好的细胞形态的胚胎干细胞,传代(三)拥挤的牢房准备。

Discussion

与胚胎干细胞时,在任何时候都必须保持无菌。清洗和消毒的生物安全柜在使用前,所有设备。所有的试剂,使用0.22微米孔径过滤器在使用前必须经过过滤。 antiboiotics在使用胚胎干细胞培养,是没有必要的,应该避免。

应该成立一个单独的环境作为一个指定的配货站。站无菌外壳可以是一个静态的外壳用的紫外线光源,层流罩,或生物安全柜(如PCR技术工作站)。需要一个分拣站内的解剖显微镜观察菌落有区别的地区都将被删除。一个静态的外壳或生物安全柜前玻璃面板,必须进行修改,以允许在显微镜的目镜,通过面板​​扩展,而不影响正常的气流和无菌。

要保持健康的胚胎干细胞培养,细胞传代的最佳时机,通常每4-7天。这时的殖民地已经达到其最大大小,并可能开始合并。合并后的殖民地可以增加在文化的分化率。分流比一般介于1:3和1:5的殖民地镀,扩张速度,和文化条件而定。 Overplated殖民地(分割比率太低)可能会过早地合并和需要代才达到其最大大小。

MEF饲养层,是2周以上的历史文化,必须将支持未分化生长和增殖的新MEFs传。

由于胚胎干细胞培养分化自然发生的,少量的预期。频繁或过度分化可能发生的文化,如果没有得到适当的照顾。细胞必须每天喂,段落之间的过度生长,应避免。请务必使用新的试剂。所有的媒体,MEFs和试剂应使用14天之内,以避免未分化的胚胎干细胞的生长。大量的试剂,如基因敲除血清替代,FBS和MEFs,使用前应进行筛选。请记住,以传代之前不会删除任何分化的细胞将被转移到新的文化。另外,尽量保持在37 ° C尽可能的细胞。最小的细胞花费的孵化器外(例如,在显微镜阶段或在生物安全柜。)加热显微镜阶段可以是非常有益的,如果细胞的孵化器长时间。

在显微镜下观察胚胎干细胞培养时,先评估的整体素质和规模的殖民地视图中使用了低功耗(2倍或5倍)的目标。如果可能分化的细胞在低功耗观察,确认使用高倍物镜(10X)的分化形态。

后立即删除分化,殖民地的边缘可能会出现锯齿状或损坏。在新鲜培养基孵育过​​夜的殖民地,让剩余的未分化的细胞恢复。如果没有在文化差异的影响,这些剩余的殖民地将继续增殖正常。

如果可能的话,开始使用低通过胚胎干细胞的实验。主要实验之前和之后的所有染色体核型的细胞。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-MEM Invitrogen 11965-092 For MEF medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified Invitrogen 16000-044 Heat-inactivated
For MEF medium
D-MEM/F-12 Invitrogen 11330-057
Knockout™ Serum Replacement Invitrogen 10828-028 Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF Stemgent 03-0002 Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 mM (100X)
Use at [1X] final
PBS Invitrogen 14190-250 Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin Sigma-Aldrich G1890 Type A, Porcine
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined Hyclone SH300.70.01 For freezing medium
6-well plates Nalge Nunc international 140675 For general culture
4-well plates Nalge Nunc international 176740 For thawing
5 mL glass pipets Fisher Scientific 13-678-27E Individually wrapped
15 mL conical tubes Corning 430052 Polypropylene
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D 9” glass

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References

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 5th edition, Wiley-Liss. (2005).

Comments

4 Comments

  1. Isn't it published already in JoVE?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2009 - 3:43 PM
  2. From JoVE Editor: we aim to have more than one video-article published for specific methods, especially for popular methods such as culture of ES cells. This is to document and disseminate different ways to perform same experiments to ensure users can choose which to apply in their labs, dependent on the context of their experiments.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 23, 2009 - 3:59 PM
  3. Hi,in our lab,Enzyme Incubation need 15-²0 min, could you give me some clue about how could this happened?
    Many thanks!

    Reply
    Posted by: Song W.
    November 13, 2012 - 11:14 PM
  4. Hello! I've just recently started working with a couple of pluripotent stem cell lines (derived by nuclear transfer or induced expression of specific transcription factors). The culturing protocol provided to us specifies the use of trypLE as the dissociation reagent. My first attempt to passage after thawing these lines was problematic - after the 3 minute incubation, the colonies, along with the MEF feeder layer detached from the plate as one big sheet. At no point did I see the characteristic "curling back" of colony edges. Subsequent attempts to dissociate this "sheet" of cells by pipetting were largely unsuccessful. It was a very stringy, sticky mass of cells. Where did I go wrong? Any suggestions/advice would be much appreciated!

    Reply
    Posted by: Xenia S.
    September 8, 2016 - 8:30 AM

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