La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Biology
 

Summary

Este protocolo demuestra cómo mantener sano, indiferenciada madre embrionarias humanas (ES) las células.

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Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells . J. Vis. Exp. (34), e1427, doi:10.3791/1427 (2009).

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Abstract

Madre embrionarias humanas (HES), las células deben ser supervisados ​​y atendidos con el fin de mantener los cultivos sanos, indiferenciado. Como mínimo, las culturas deben ser alimentados todos los días llevando a cabo un cambio de medio completo para reponer los nutrientes perdidos y mantener los cultivos libres de factores de diferenciación no deseados. Aunque una pequeña cantidad de diferenciación es normal y esperable en cultivos de células madre, la cultura debe ser limpiados en forma rutinaria por la eliminación manual o "picking" áreas diferenciadas. Identificar y eliminar el exceso de diferenciación de los cultivos celulares hES son técnicas esenciales en el mantenimiento de una población saludable de las células.

Protocol

1. Mantenimiento: Los cultivos de observación bajo el microscopio

  1. Quitar una placa de células hES de la incubadora a 37 ° C y llevar al microscopio.
  2. Observe las colonias a baja potencia, con aumento de 2X o 5 veces, para evaluar la calidad de la cultura en general. Tenga en cuenta lo siguiente: color medio normal, la ausencia de cualquier tipo de contaminación visible, tamaño de la colonia en general, la calidad y la densidad, y cualquier otra observación.
  3. Observar los cambios de color medio. Debido al cambio en el pH y el agotamiento de los nutrientes en el medio después de una noche de incubación con las células hES, el medio va a cambiar de un tono rojo a la "paja" de color. Si el medio aparece púrpura, un cambio de pH básico se ha producido. Si el medio aparece muy amarillo, que el medio se acidifica. Medio muy amarilla puede ser el resultado de colonias muy hacinados en el pozo o la contaminación. El medio debe ser transparente en todo momento. A pesar de un cierto nivel de restos celulares en el medio es normal, que nunca debe aparecer nubes. Si un alto nivel de los desechos celulares se observa, la cultura no es saludable y puede estar contaminada.
  4. Si los cultivos no requieren mantenimiento o pases, que pueden ser llevados a la cabina de seguridad biológica a ser alimentado (ver sección 2).
  5. Si las culturas contienen más de un 10% diferenciar las colonias, las células deben ser "limpiado" por la eliminación manual de las áreas diferenciadas (ver sección 3).
  6. Si las culturas contienen grandes colonias o denso, o la capa de alimentación MEF es más de 12 días, las células deben ser pasados ​​(ver sección 4).

2. Las células de alimentación hES

  1. En una cabina de seguridad biológica estéril, retire la tapa de la placa de cultivo y se aspira el medio empleado. No permita que la punta de la pipeta toque ninguna parte de la placa que no sea directamente en el interior de los pozos. Si hay alguna preocupación de la contaminación, el cambio de una pipeta nueva y estéril.
  2. Con una pipeta de vidrio estéril, añada la cantidad apropiada de medio de cultivo calentado hES celular a cada pocillo. Para las culturas en una placa de 6 pocillos, agregar 2,5 ml de medio por pocillo.
  3. Devolver la placa a la incubadora para permanecer a 37 ° C y 5% CO 2.

3. La eliminación de la diferenciación de cultivos celulares hES

  1. Transformar de 9 pulgadas de cristal pipetas Pasteur en instrumentos de recogida mediante moldeo por los consejos sobre la llama controlada de un mechero de alcohol. Asegúrese de que la punta de la pipeta está sellado para evitar la contaminación y redondeados para evitar rayar el plástico de la placa de cultivo. Esterilizar los instrumentos de recogida antes de su uso con la fuente de luz UV en la cabina de seguridad biológica o recoger recinto.
  2. Eliminar las áreas diferenciadas. Diferenciación ocurre a menudo en sólo una parte de una colonia de células HES, por lo general a lo largo de los bordes o en forma de manchas aisladas en el centro. Si sólo una parte de una colonia es la diferenciación, sólo el área diferenciada debe ser eliminado. Diferenciación a menudo puede levantar de la placa en una "pegajosa" de la hoja, y es útil primero separar las células diferenciadas del resto de la colonia, trazando una línea a través de la colonia con el fin de la herramienta de selección.
  3. Una vez que las piezas de la colonia se separan, se deslizan suavemente la herramienta de selección a lo largo de la placa para separar las células no deseadas. Tenga cuidado de no raspar demasiado de la capa de alimentación MEF entre las colonias en este proceso.
  4. Cuando todas las células diferenciadas se retira de la placa (y flotan en el medio), el retorno de la cultura a la cabina de seguridad biológica. Aspirar el medio que contiene las células diferenciadas y reemplazar con medio de cultivo fresco hES celular.

4. Pases hES células

Enzima de incubación

  1. En una cabina de seguridad biológica estéril, retire la tapa de la placa de cultivo de 6 pocillos y aspirar el medio gastado de los pozos a ser pasados. No permita que la punta de la pipeta toque ninguna parte de la placa que no sea directamente en el interior de los pozos.
  2. Con una pipeta de vidrio estéril, agregar 1 ml de colagenasa IV calentado a cada pocillo para pasarse.
  3. Devolver la placa a la incubadora a 37 ° C durante 5 minutos.

Raspado y la agrupación de las células hES

  1. Después de incubar las células con colagenasa, observar las colonias bajo el microscopio. La enzima que causa un cambio sutil, pero se observa en los bordes de la colonia.
  2. En la cabina de seguridad biológica, suavemente aspire a la enzima de cada bien y reemplazar con 2,0 ml de medio de cultivo hES celular.
  3. La punta de la placa de cultivo ligeramente hacia usted y tome el medio de 2,0 ml en el primer pocillo con una pipeta de vidrio de 5 ml. La celebración de la pipeta perpendicular a la parte inferior de la placa, se deslizan suavemente la punta de la pipeta a través del bien, mientras que poco a poco soltando el medio. Repita el raspado y pipetear 4.3 veces el movimiento hasta que todas las colonias se han retirado del pozo. Pipeta con cuidado para no romper las colonias en muy pequeña de las piezas.   Cuando las células se han quitado del primer pozo, dejar el contenido en el pozo y comenzar a raspar las células fuera de la próxima también.
  4. Cuando todos los pozos a ser pasados ​​han sido raspadas, la piscina del medio que contiene las piezas de cada colonia y en un tubo estéril de 15 mL cónico.
  5. Lave los pocillos raspada por la adición de 1 ml de medio de cultivo celular hES a cada pocillo. Recoge este enjuague y traslado al tubo cónico.
  6. Pipeta suavemente las células en el tubo para romper las piezas colonia hasta el tamaño deseado.
  7. Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g.

Revestimiento de las células de la célula hES

  1. Mientras que las células son hES en la centrífuga, preparar una nueva placa de 6 pocillos de alimentación MEF. Etiqueta de la placa con la información de la célula apropiada hES: la línea celular, el número de pases nuevos, y la fecha de aprobación. Aspirar el medio MEF de los pozos y añadir 1,0 ml de PBS en cada pocillo. Remover con suavidad la seguridad alrededor de los pozos y aspirar el lavado con PBS. Añadir 1,5 ml de células hES medio de cultivo para cada bien y dejar a un lado del plato.
  2. Cuando las células hES terminado de centrifugación, llevar el metro de vuelta a la cabina de seguridad biológica. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar la suelta llena de sedimento celular.
  3. Resuspender las células en el sedimento con un medio suficiente para 1 ml de medio de cultivo celular por hES así a ser plateado. Cuando se divide en 6 nuevos pozos, resuspender el precipitado en un medio de 6 ml.
  4. Suave y uniformemente agregar 1 ml de la suspensión celular a cada bien preparado de la placa de alimentación MEF.
  5. Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C y deslice la placa de adelante hacia atrás, de lado a lado para distribuir uniformemente las células a través del pozo.
  6. Permiten a las células para conectar a 37 ° C durante la noche.

5. Los resultados representativos:

Indiferenciado de células hES son pequeños, bien repleto, y por lo general consisten en mayor extensión, más por las células. La diferenciación puede ocurrir dentro de una colonia (Figura 1) o entre las colonias (Figura 3B).

Morhopologies diferente puede ser visto con una lupa de baja bajo el microscopio. Una buena morfología de las células, como se ve en la Figura 2A, contiene células pequeñas, apretadas que crecen en una monocapa. Las células deben tener bordes limpios y definidos, con poca o ninguna diferenciación. Las células se muestra en la Figura 2B están listos para los pases, y las células se muestra en la Figura 2C están saturados.

Figura 1
Figura 1. Diferenciación en las culturas hES. (A) la diferenciación de una colonia (B) la diferenciación entre las colonias.

Figura 2
Figura 2. Morfologías visto en las culturas hES. (A) morfología de las células buenas (B) Las células hES que están listos para pases (C) celdas superpobladas.

Discussion

La esterilidad se debe mantener en todo momento cuando se trabaja con células hES. Limpiar y esterilizar la cabina de seguridad biológica y todo el equipo antes de su uso. Todos los reactivos deben ser filtrados mediante un filtro de 0,22 micras de tamaño de poro antes de su uso. El uso de antiboiotics en cultivo celular hES no es necesario y debe ser evitado.

Un ambiente separado se debe configurar como una estación de recogida designados. El recinto estéril para la estación puede ser una caja estática (como una estación de trabajo PCR) con una fuente de luz UV, una campana de flujo laminar, o una cabina de seguridad biológica. Un microscopio de disección dentro de la estación de recolección es necesario para observar las colonias de las zonas diferenciadas se eliminan. El panel de cristal delantero de un recinto estática o una cabina de seguridad biológica debe ser modificada para permitir los oculares del microscopio se extienden a través del panel sin comprometer la correcta circulación del aire y la esterilidad.

Para mantener sanos los cultivos celulares hES, las células deben ser pasados ​​en el momento óptimo, por lo general cada 4-7 días. En este momento, las colonias han alcanzado su tamaño máximo y puede ser empezando a unirse. Colonias combinado puede aumentar la tasa de diferenciación en la cultura. Coeficientes de distribución en general, la caída 01:03-01:05, en función del número de colonias plateado, la tasa de expansión, y las condiciones de cultivo. Colonias Overplated (relación de división demasiado baja) probablemente se fusionarán antes de tiempo y necesitan ser pasados ​​antes de alcanzar su tamaño máximo.

Culturas en una capa de alimentación MEF que es más de 2 semanas de edad deben ser pasados ​​al nuevo MEFs que apoyar el crecimiento y la proliferación indiferenciada.

Ya que la diferenciación se produce naturalmente en los cultivos celulares hES, una pequeña cantidad que se espera. Diferenciación frecuente o excesiva puede ocurrir si los cultivos no reciben la atención adecuada. Las células deben ser alimentados todos los días, el crecimiento excesivo entre los pasajes deben ser evitados. Siempre use reactivos nuevos. Todos los medios de comunicación, MEFs y los reactivos deben ser utilizados dentro de 14 días para evitar el crecimiento indiferenciado de células hES. Nuevos lotes de reactivos, tales como la sustitución de golpe de gracia en suero, FBS y MEFs, deben ser examinados antes de su uso. Recuerde que las células diferenciadas no se elimina antes de que pases serán transferidos a las nuevas culturas. Además, trate de mantener a las células a 37 ° C siempre que sea posible. Minimizar el tiempo de las células pasan fuera de la incubadora (por ejemplo, en la platina del microscopio o en la cabina de seguridad biológica.) Una platina del microscopio con calefacción puede ser muy beneficioso si las células se de la incubadora durante largos períodos de tiempo.

Cuando se observan los cultivos celulares hES bajo el microscopio, en primer lugar evaluar la calidad global y el tamaño de las colonias de vista con una potencia baja (2x o 5x) objetivo. Si las células potencialmente diferenciadas se observan a baja potencia, confirmar la morfología diferenciada utilizando un objetivo de mayor aumento (10X).

Inmediatamente después de la eliminación de la diferenciación, los bordes de las colonias pueden aparecer irregulares o dañadas. Incube las colonias durante la noche en un nuevo medio para que el resto de células no diferenciadas para recuperarse. Sin la influencia de la diferenciación en la cultura, las colonias restantes seguirán proliferando con normalidad.

Si es posible, comenzar los experimentos con células de paso bajo hES. Cariotipo de las células antes y después de todos los experimentos más importantes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-MEM Invitrogen 11965-092 For MEF medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified Invitrogen 16000-044 Heat-inactivated
For MEF medium
D-MEM/F-12 Invitrogen 11330-057
Knockout™ Serum Replacement Invitrogen 10828-028 Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF Stemgent 03-0002 Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 mM (100X)
Use at [1X] final
PBS Invitrogen 14190-250 Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin Sigma-Aldrich G1890 Type A, Porcine
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined Hyclone SH300.70.01 For freezing medium
6-well plates Nalge Nunc international 140675 For general culture
4-well plates Nalge Nunc international 176740 For thawing
5 mL glass pipets Fisher Scientific 13-678-27E Individually wrapped
15 mL conical tubes Corning 430052 Polypropylene
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D 9” glass

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References

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 5th edition, Wiley-Liss. (2005).

Comments

4 Comments

  1. Isn't it published already in JoVE?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2009 - 3:43 PM
  2. From JoVE Editor: we aim to have more than one video-article published for specific methods, especially for popular methods such as culture of ES cells. This is to document and disseminate different ways to perform same experiments to ensure users can choose which to apply in their labs, dependent on the context of their experiments.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 23, 2009 - 3:59 PM
  3. Hi,in our lab,Enzyme Incubation need 15-²0 min, could you give me some clue about how could this happened?
    Many thanks!

    Reply
    Posted by: Song W.
    November 13, 2012 - 11:14 PM
  4. Hello! I've just recently started working with a couple of pluripotent stem cell lines (derived by nuclear transfer or induced expression of specific transcription factors). The culturing protocol provided to us specifies the use of trypLE as the dissociation reagent. My first attempt to passage after thawing these lines was problematic - after the 3 minute incubation, the colonies, along with the MEF feeder layer detached from the plate as one big sheet. At no point did I see the characteristic "curling back" of colony edges. Subsequent attempts to dissociate this "sheet" of cells by pipetting were largely unsuccessful. It was a very stringy, sticky mass of cells. Where did I go wrong? Any suggestions/advice would be much appreciated!

    Reply
    Posted by: Xenia S.
    September 8, 2016 - 8:30 AM

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