تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

Published 10/29/2009
7 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

تغيير طبيعة استخدام هلام بولي أكريلاميد الكهربائي لفصل واحد اليوريا الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي أو تصل إلى حد 500 النيوكليوتيدات. اليوريا في تركيبة مع عينات يبدل طبيعة الحرارة وضيق واحد غير منظمة الهجرة داخل المصفوفة هلام وفقا لوزنها الجزيئي.

Cite this Article

Copy Citation

Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE). J. Vis. Exp. (32), e1485, doi:10.3791/1485 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

PAGE اليوريا أو تغيير طبيعة الكهربائي اليوريا هلام بولي أكريلاميد توظف 6-8 اليوريا M ، الذي يبدل طبيعة الحمض النووي الريبي الثانوية أو هياكل ، ويستخدم لانفصالهما في المصفوفة هلام بولي أكريلاميد على أساس الوزن الجزيئي. شظايا بين 2-500 القواعد ، مع وجود اختلافات طول صغيرة مثل النوكليوتيدات واحد ، يمكن فصلها باستخدام هذا الأسلوب 1. الهجرة من العينة يعتمد على تركيز مادة الأكريلاميد المختار. نسبة مئوية أعلى من بولي أكريلاميد يحل شظايا الوزن الجزيئي أقل. مزيج من اليوريا ودرجات الحرارة من 45-55 درجة مئوية خلال تشغيل هلام يسمح لفصل الحمض النووي غير منظم أو جزيئات الحمض النووي الريبي.

عموما مطلوب هذا الأسلوب لتحليل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل أو تنقية واحد أو شظايا الحمض النووي الريبي ، مثل [أليغنوكليوتيد] توليفها أو المسمى أو المنتجات من ردود الفعل الأنزيمية الانقسام.

في هذه المقالة الفيديو نظهر كيفية إعداد وتشغيل بولي أكريلاميد اليوريا تغيير طبيعة المواد الهلامية. نصائح يتم تضمين التقنية ، بالإضافة إلى 1،2 البروتوكول الأصلي.

Protocol

النص الكامل للبروتوكول ومفصلة عن هذا الإجراء التجريبي يتوفر في البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئية. ويمكن العثور مفصلة خطوة بخطوة تعليمات لتجميع وهلام ساندويتش لجهاز الجل على موقع BioRad 3.

المعدات المطلوبة :
ألواح الزجاج (الداخلي والخارجي)
10 خلية الطول : 10.1 X 7.3 سم (لوحة داخلية) ، 10.1 X 8.2 سم (لوحة الخارجي) ، BioRad
20 خلية الطول : 20 × 20 سم (لوحة داخلية) ، 20 × 22.3 سم (لوحة الخارجي) ، BioRad
0،5-1،5 مم المشط جل والفواصل
صب جل الوقوف
هلام مع غطاء الجهاز والكابلات
ارتفاع امدادات الطاقة الفولطية
كتلة تدفئة أو ماء الحمام
ماصات المصلية والمساعدات الماصة
ماصة ونصائح الماصة
مجفف هلام أو الماسح الضوئي

الكواشف والحلول :
اليوريا (عالى النقاء)
حل 40 ٪ بولي أكريلاميد (29:1)
10 × TBE الحل (تريس ، البورات ، EDTA العازلة)
منزوع الأيونات والماء المقطر
TEMED
30 ٪ (W / V) الأمونيوم حل بيرسلفات
0.5 X حل TBE
Formamide
EDTA
الزيلين cyanol
برومفينول الزرقاء
الميثانول
الإيثانول

حجم 50 مل 60 مل 10 مل
تركيز مادة الأكريلاميد 10 ٪ 12.5 ٪ 15 ٪ 10 ٪ 12.5 ٪ 15 ٪ 10 ٪ 12.5 ٪ 15 ٪
ز اليوريا 24 24 24 28.8 28.8 28.8 4.8 4.8 4.8
مل الاكريليك 40 ٪ (29:1) 12.5 15.625 18.75 15 18.75 22.5 2.5 3،125 3.75
المجاهدين الجزائرية 30 ٪ 166 166 166 199.2 199.2 199.2 33 33 33
UL TEMED 20 20 20 24 24 24 4 4 4
10 × TBE 5 5 5 6 6 6 1 1 1
تملأ حجم بالماء المقطر منزوع الأيونات

الجدول رقم 1 : الكواشف والحلول اللازمة لتركيزات مختلفة وأحجام الأكريلاميد لتسوية [أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل واحد

هلام التجمع ساندويتش وإعداد جيل

  1. تجميع جل وفقا للمصنعين وصفا وإصلاح هلام في هلام غرفة الصب 3. استخدام الفواصل سميكة 0،5-1،5 مم.
  2. يعد الحل المناسب بولي أكريلاميد وفقا لبروتوكولات الحالية في مجال البيولوجيا الجزيئية أو كما هو موضح في الجدول رقم 1. لتغيير طبيعة هلام الأكريلاميد من 20 سم x 22 سم x 1.5 ملم ، و 60 مل من محلول هلام وعن 10.1 سم X 8.2 مم × 1 هلام هلام مل محلول 5 كافية. وتستخدم المواد الهلامية أكبر عندما المنتجات المتوقعة / نطاقات ضمن نطاق من قواعد قليلة ، فسوف أطول جل حل العصابات مع فارق واحد من النوكليوتيدات. إذا كانت العصابات المتوقع تختلف في أكثر من 10 النيوكليوتيدات ، وسوف تكون مناسبة أصغر المواد الهلامية لحل شظايا. اختر النسبة المئوية للبولي أكريلاميد التي تناسب متطلبات الفصل الخاص ، سوف تركيزات أعلى بولي أكريلاميد حل شظايا انخفاض الوزن الجزيئي. استخدام اليوريا عالى النقاء والاختلاط مع المبلغ المطلوب من مادة الأكريلاميد. إضافة العازلة TBE إلى مزيج هلام للحصول على التركيز النهائي للTBE س 0،5-1 وتملأ حجم بالماء المقطر منزوع الأيونات. الحل الحرارة لمدة 20 ثانية في الميكروويف ومزجها برفق. لأحجام أكبر هلام كرر هذه الخطوة حتى الحل هو دافئ اليد.
  3. صب جل فورا باستخدام ماصة المصلية ومساعدات ماصة التلقائي بين لوحات من الزجاج اثنين. تجنب إدخال فقاعات الهواء. إدراج المشط ، والسماح للهلام تتبلمر عن 30-60 دقيقة.

إعداد الجهاز الكهربائي وprerun الجل

  1. ترجل الجل من غرفة الصب والتجميع على جهاز جل وفقا لتعليمات بتصنيع 3.
  2. ملء الغرفة السفلى العازلة العازلة الطرافة تشغيل (0.5-1 TBE س) أن لوحات زجاجية سيتم الفرعيةاندمجت 2-3 سم مع العازلة. ملء الغرفة العازلة العلوي يصل إلى الجزء العلوي من هلام مع تشغيل العازلة.
  3. إزالة بعناية المشط وشطف تشغيل الآبار مع العازلة باستخدام ماصة وهلام تحميل النصائح.
  4. نعلق غطاء للنظام الجل وتوصيل كابلات لامدادات الطاقة العالية الجهد. قبل أن تتمكن من تحميل العينات الخاصة بك لديك لprerun جل ما لا يقل عن 30 دقيقة لتصل الحرارة الجل واليوريا لإزالة ما تبقى من هلام. يجب أن تكون درجة الحرارة المثلى بين 45-55 درجة مئوية. تجنب ارتفاع درجات الحرارة من 60 درجة مئوية ويمكن ان العصابات أو تشويه لوحات زجاجية يمكن خرقها. اختيار واط المستمر لprerun (15-25 واط لكل هلام).

نموذج إعداد

  1. في غضون ذلك إعداد العينات الخاصة بك. لذلك ، إضافة كمية مناسبة من هلام 2 × مزيج التحميل لعينتك. وعادة ما تحتوي على مزيج تحميل formamide 90 ٪ ، و 0.5 ٪ EDTA ، cyanol الزيلين 0.1 ٪ و 0.1 ٪ برومفينول الزرقاء.
  2. قبل أن يتم تحميل العينات في الجل ، يجب أن تكون حرارة العينات التشويه والتحريف عن طريق تسخين العينات بين 70-90 درجة مئوية لمدة بضع دقائق.

تحميل وتشغيل الجل

  1. عند الانتهاء من prerun ، إزالة الغطاء وشطف جيوب بدقة كما هو موضح كما كان من قبل قد ترشح اليوريا في الآبار.
  2. تطبيق العينات بعناية من أسفل الجيب. تجنب إدخال فقاعات الهواء. تحميل العازلة يجب أن تطبق على جيوب فارغة للحفاظ على ظروف متساوية أثناء التشغيل.
  3. تجميع وتشغيل الغطاء هلام في واط مستمرة للحفاظ على درجة حرارة 55 درجة من هلام مشابهة لما prerun C. مراقبة الهجرة من الأصباغ العلامة حتى الجبهة صبغ بلغ أدنى حد من هلام. مدة تشغيل يعتمد على نسبة من مادة الأكريلاميد المستخدمة ، وقوة الأيونية للالعازلة وسمك هلام. ويمكن لتشغيل الماضي بين 2-4 ساعات.
    الاختيار على درجة حرارة هلام. ويمكن لميزان الحرارة هلام يساعد على مراقبة درجة الحرارة المناسبة أثناء التشغيل.

عملية الجل

  1. عند الجبهة صبغ وصلت الى نهاية للوضع الجل الجل من الغرفة السفلى العازلة. إزالة هلام من الغرفة وتخفيف المشابك. أبتعد الفواصل وراءى بعناية لوحات زجاجية. إذا كان ذلك ضروريا خفض بعيدا العليا التي تحتوي على جزء جيد هلام.
  2. نقل بعناية الجل في الطبق مع الحل التثبيت هلام (نفس التركيز من الميثانول TBE زائد 50-10 ٪ ، والايثانول). ترك الجل في المحلول لمدة 5-10 دقائق وتغيير المخزن مرتين.
  3. الجل مستعدة لمزيد من المعالجة باستخدام مجفف فراغ أو هلام المسح المباشر للهلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

  1. الحدة الفرقة تعتمد على عدة عوامل. وينبغي أن حجم العينة لتحميل أشرطة حادة تكون صغيرة قدر الإمكان ، من الناحية المثالية أي بين 1-5 ميكرولتر. ومع ذلك ، يمكن تحميل ما يصل إلى 15 ميكرولتر التي تضمن القرار ما زالت مقبولة. حجم العينة أقل من النتائج أكثر وضوحا في العصابات.
  2. نوعية الفرقة هو أيضا يعتمد على سمك هلام. أرق المواد الهلامية ، مثل 0،75 ملم تظهر نتائج أفضل من المواد الهلامية سميكة 1.5 ملم.
  3. ويمكن أيضا على شكل عصابات تتأثر أثناء التحميل هلام ، إذا لم يتم تطبيق العينة بالتساوي في جيب هلام. بما في ذلك الجلسرين 10 ٪ في المنطقة العازلة تحميل يساعد أثناء تحميل الجل والبواليع في العينة بسهولة أكثر جيدا.
  4. يمكن مشكلة محتملة أخرى متصلة مع العينة العازلة تحميل يحدث ، إذا كان المنتج المتوقع (ق) يعمل على نفس مستوى واحد من الأصباغ التحميل. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم استخدام تسميات الفلورسنت ، وبعض الأصباغ وتظهر إشارة الفلورسنت في طول موجة مماثلة. إذا كان هذا هو الحال يمكن إزالة أحد الأصباغ أو صبغ كل حل هذه المشكلة. ثم ينصح لتشغيل العينة التي تحتوي على الصبغة في بئر فارغة كمعيار الحجم.
  5. الجهد المنخفض في بداية تشغيل يساعد أيضا على الحصول على أدق العصابات ، كما يدخل عينة الجبهة هلام بسلاسة وأنه يتجنب هذا الانهيار بسبب جيوب جل الجهد العالي. ويمكن لمادة الأكريلاميد قصيرة الجل التراص نسبة منخفضة (4 ٪) لديهم نفس الفرقة شحذ المفعول.
  6. مشكلة غالبا ما واجه هو هلام "يبتسم" ، والذي يرجع إلى التوزيع غير المتساوي للحرارة من خلال هلام خلال الكهربائي. إذا لم تكن محاطة الجل بواسطة العازلة ، بحسب النظام الذي يعمل هلام ، وإرفاق لوحة معدنية لوحة من الزجاج يعتمد على توزيع الحرارة على قدم المساواة ، ويمكن زيادة كبيرة في نوعية الجل.
  7. ينصح Silanizing لوحات من الزجاج للحصول على أكبر الهلام ، لأنه يحسن إلى حد كبير التعامل مع المواد الهلامية بعد تشغيل ، والمواد الهلامية تميل إلى التمسك ألواح الزجاج.

تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (سماد اليوريا - PAGE) مفيد لتحليل أو منفصلة المفرد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي أو شظايا وكذلك عينات radionucleotide أو المسمى الفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل مجلس سنغافورة البحوث الأكاديمية (ARC) [منح عدد 90/07]. نشكر Radiodurans للدعم.

References

  1. Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
  2. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. (2001).
  3. PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. Biorad. (2001).

Comments

7 Comments

  1. Excellent! We are looking for a electrophoresis uniit which can run ²0 cm (W) X ²5 cm (L) denaturing gels. Could you please suggest vendors from who we could purchase those apparatus.

    Dr. Pradeepkumar, IIT Bombay

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2009 - 5:15 AM
  2. Dear Dr. Pradeepkumar,
    You could use the Biorad Sequencing gel system or the adjustable height vertical gel system available from Sigma.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 24, 2009 - 9:07 PM
  3. Sir i am doing denaturing gel for microsatellites. my gel is 40X²0 cm in size. could you tell me the running conditions for the gel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2010 - 3:13 AM
  4. That is awesome. I have an question that PAGE can be used to purify sinlge-stranded DNA pool that I bought from biocompany?
    Thank you!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 20, 2011 - 2:14 PM
  5. Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 9:31 AM
  6. why to prerun the gel in formamide gel electrophoresis for rna

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 4, 2012 - 12:54 AM
  7. Great, Can you suggest me to get a better resolution of Nuclease reaction products on 12% dPAGE, DO i need to run gel at 40 degree environment or like your video at RT ?

    Currently i am running them at RT, but resolution is not crystal clear.

    With regards,

    Reply
    Posted by: kumar v.
    February 26, 2016 - 2:00 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats