Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA)

Published 10/29/2009
7 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Denatüre üre poliakrilamid jel elektroforezi ayrı tek iplikli DNA veya RNA 500 nükleotidlerin bir sınıra kadar kullanılır. Üre, ısı denatüre örnekleri ve yapılandırılmamış tek iplikçikler ile birlikte moleküler ağırlığına göre jel matriks içinde göç ederler.

Cite this Article

Copy Citation

Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE). J. Vis. Exp. (32), e1485, doi:10.3791/1485 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Üre SAYFA veya üre poliakrilamid jel elektroforezi denatüre ikincil DNA veya RNA yapıları yıkılır ve molekül ağırlığı dayalı bir poliakrilamid jel matris ayrılması için kullanılan 6-8 M üre, istihdam etmektedir. 2 ila 500 üsleri arasında parçaları, bir tek nükleotid gibi küçük uzunluğu farklılıklar, bu yöntemi kullanarak 1 ayrılabilir. Örnek göç seçilen akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır. Poliakrilamid bir daha yüksek oranda düşük molekül ağırlıklı parçaları giderir. Kombinasyonu üre ve sıcaklıklar 45-55 ° C jel çalışması sırasında yapılandırılmamış DNA veya RNA molekülleri birbirinden ayrılması için izin verir.

Genel olarak bu yöntem, tek iplikli DNA veya RNA parçaları, enzimatik parçalanma reaksiyonlarını sentezlenmiş veya etiketli oligonükleotidler veya ürünlerin analiz veya arındırmak için gereklidir.

Bu video makalede denatüre üre poliakrilamid jeller hazırlamak ve çalıştırmak için nasıl göstermektedir. Orijinal protokol 1,2 ek olarak, teknik ipuçları yer almaktadır.

Protocol

Bu deneysel prosedür için tam ve ayrıntılı bir metin protokol Moleküler Biyoloji Mevcut Protokoller kullanılabilir. Ayrıntılı adım adım talimatlar, jel sandviç montajı için ve jel cihazlar için 3 BioRad web sitesinde bulunabilir.

Gerekli ekipman:
Cam levhalar (iç ve dış)
10 cm hücresi: 10,1 x 7,3 cm (iç plaka), 10,1 x 8,2 cm (dış plaka), BioRad
20 cm hücre: 20 x 20 cm (iç plaka), 20 x 22,3 cm (dış plaka), BioRad
0.5-1.5 mm jel tarak ve ayırıcılar
Jel döküm standı
Kapak ve kablolar ile Jel cihazlar
Yüksek gerilim güç kaynağı
Isıtma blok veya su banyosu
Serolojik pipetler ve Pipet yardım
Pipet ve pipet uçları
Jel kurutma makinesi veya tarayıcı

Reaktifler ve Çözümleri:
Üre (ultra saf)
% 40 poliakrilamid çözüm (29:1)
10 x TBE çözeltisi (Tris-borat, EDTA tampon)
Deiyonize, distile su
TEMED
% 30 (w / v) amonyum persülfat çözümü
0,5 x TBE çözüm
Formamid
EDTA
Ksilen cyanol
Bromphenol mavi
Metanol
Etanol

Hacim 50 ml 60 ml 10 ml
Akrilamid konsantrasyonu % 10 % 12.5 % 15 % 10 % 12.5 % 15 % 10 % 12.5 % 15
g ÜRE 24 24 24 28,8 28,8 28,8 4,8 4,8 4,8
ml% 40 Akrilik (29:1) 12,5 15,625 18,75 15 18,75 22,5 2,5 3,125 3,75
ul 30% APS 166 166 166 199,2 199,2 199,2 33 33 33
ul TEMED 20 20 20 24 24 24 4 4 4
10 x TBE 5 5 5 6 6 6 1 1 1
Hacim deiyonize, distile su ile doldurun

Tablo 1: tek telli oligonükleotidler çözmek için çeşitli akrilamid konsantrasyonları ve hacimleri için gerekli Reaktifler ve çözümler

Jel sandviç montaj ve jel hazırlama

  1. Jel üreticileri açıklamasına göre birleştirin ve jel-döküm haznesi 3 jel düzeltmek. 0.5-1.5 mm kalınlığında ayırıcılar kullanın.
  2. Moleküler biyoloji alanındaki mevcut protokollere göre uygun poliakrilamid çözüm hazırlayın ya da Tablo 1'de listelenmiştir. Denatüre akrilamid jel 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml jel çözüm ve 10.1 x 8.2 cm x 1 mm jel 5 ml jel çözüm için yeterli olacaktır. Birkaç üslerinden aralığında beklenen ürünler / bantlar Büyük jeller kullanılır, daha sonra uzun bir jel tek nükleotid bir fark bantları çözecektir. Beklenen bantları 10'dan fazla nükleotidler farklılık varsa, küçük jeller parçaları çözmek için uygun olacaktır. Ayırma gereksinimlerinin uygun poliakrilamid yüzdesi seçin, daha yüksek bir poliakrilamid konsantrasyonları daha düşük molekül ağırlığı parçaları çözecektir. Ultra saf üre ve istenilen miktarda akrilamid karışımı kullanın. 0.5-1 x TBE nihai bir konsantrasyon ve hacim deiyonize, distile su ile doldurmak için TBE tampon jel karışımı ekleyin. Mikrodalga fırında 20 saniye boyunca çözüm Isı ve hafifçe karıştırın. Çözüm yandan ısınana kadar büyük jel hacimleri için bu adımı tekrarlayın.
  3. Hemen bir serolojik pipet ve iki cam levha arasında otomatik bir pipet yardımı ile jel dökün. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Tarak yerleştirin ve 30-60 dakika süreyle jel polimerize.

Elektroforez cihazı kurmak ve jel prerun

  1. Talimatları 3 üretmektedir göre döküm haznesi ve jel aparat montaj jel ayırın.
  2. Dolgu, cam plakalar, alt olacağını alt tampon odasına zekâ çalışan tampon (0.5-1 x TBE)tamponu ile 2-3 cm birleşti. Tampon çalışan jel top üst tampon odasına kadar doldurun.
  3. Tarak dikkatlice çıkarın ve ipuçları yükleme Bir pipet ve jel kullanarak çalışan tamponu ile kuyu durulayın.
  4. Yüksek gerilim güç kaynağı kabloları jel sistemi ve fiş kapağını takın. Örnekleri yükleyebilirsiniz önce jel ısı ve jel kalan üre kaldırmak için en az 30 dakika boyunca jel prerun var. Optimum sıcaklık 45-55 arasında olmalıdır ° C 60 daha yüksek ° C bantları, yayma veya cam plakalar çatlak olabilir olabilir. Kaçının Prerun (jel başına 15-25 W) için sabit watt seçin.

Örnek hazırlama

  1. Bu arada numunesinin. Bu nedenle, uygun miktarda örnek 2 x jel yükleme karışımı ekleyin. Yükleme karışımı genellikle% 90 formamid,% 0.5 'lik EDTA,% 0.1 ksilen cyanol ve% 0.1 bromphenol mavi içerir.
  2. Örnekleri jel yüklenecek önce, örnekler, örnekleri, birkaç dakika 70-90 ° C arasında ısıtarak ısı denatüre olmalıdır.

Jel yükleme ve çalıştırma

  1. Prerun bittiğinde kapağı kaldırmak ve iyice kuyu içine süzülen üre gibi önce açıklanan cepleri durulayın.
  2. Cebinden alttan örnekleri dikkatle uygulayın. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Yükleniyor tampon çalışması sırasında eşit koşulları sağlamak için boş cepleri uygulanacak.
  3. Kapak kurma ve 55 jel sıcaklığını korumak için sabit watt jel çalıştırmak ° C prerun benzer. Jel boya ön alt ucuna ulaşıncaya kadar marker boyaların göç uyun. Çalışma süresi kullanılan akrilamid yüzdesi, tampon ve jel kalınlığı iyonik gücü bağlıdır. Bir çalışma, 2-4 saat arasında sürebilir.
    Jel sıcaklığını kontrol edin. Bir jel termometre çalışması sırasında sağ sıcaklığını izlemek için yardımcı olabilir.

Jel Süreci

  1. Jel, boya ön jel sonuna ulaştığında alt tampon odasının söndürüldü. Odasından çıkarın ve jel kelepçeler gevşetin. Ayırıcılar dışarı doğru çekin ve dikkatle cam plakalar yüzlülük. Gerekli jel parçası içeren üst kesip durumunda.
  2. Jel, jel fiksasyon solüsyonu (TBE artı% 5-10 Metanol ve Etanol aynı konsantrasyon) dikkatlice ile bir çanak içine aktarın. 5-10 dakika çözüm jel bırakın ve tampon iki kez değiştirin.
  3. Jel, bir vakum jel kurutma makinası ya da doğrudan tarama jel kullanarak daha fazla işlem için hazırdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

  1. Grubun keskinlik, çeşitli faktörlere bağlıdır. Yani ideal 1-5 ul arasında keskin bantları için yüklenen örnek hacmi, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Ancak, 15'e kadar ul hala kabul edilebilir bir çözüm sağlar yüklenebilir. Keskin bantları daha az örnek hacmi sonuçları.
  2. Bant kalitesi de jel kalınlığına bağlıdır. 0,75 mm gibi Tiner jeller, 1.5 mm kalınlığında jeller daha iyi sonuçlar göstermektedir.
  3. Bantların şekli de örnek jel cebine eşit uygulanabilir değilse jel yükleme sırasında etkilenmiş olabilir. Yükleme tamponu% 10 gliserol de dahil olmak üzere iyi daha kolay içine jel yükleme ve örnek lavabolar sırasında yardımcı olur.
  4. Beklenen ürün (ler) yükleme boyaların biri olarak aynı düzeyde çalışır örnek yükleme tamponu ile bağlı bir diğer potansiyel sorun oluşabilir. Ayrıca, floresan etiketlerin kullanılması durumunda, bazı boyalar benzer bir dalga boyunda bir floresan sinyal göstermiyor. Eğer bu bir boya veya tüm boyalar kaldırılması durumunda bu sorunu çözebilir. Sonra bir boyut standardı olarak boş bir kuyuda boya içeren örnek çalıştırmak için tavsiye edilir.
  5. Örnek sorunsuz jel ön girer ve yüksek voltaj nedeniyle bu jel cepleri çöküşü önler olarak çalıştırmak başında Alçak gerilim de, keskin bantlar elde etmenize yardımcı olur. Jel istifleme Kısa düşük oranda akrilamid (% 4), aynı bant bilenen etkisi olabilir.
  6. Sık karşılaşılan bir sorun jel elektroforez sırasında jel ile düzensiz ısı dağılımı nedeniyle, "gülümseyerek" dir. Jel tampon ile çevrili değilse, cam plaka, metal plaka bağlama, jel sistemi kullanılmış olduğu bağlı olarak eşit ısı dağılımı destekler ve jel kalitesini önemli ölçüde artırabilir.
  7. Büyük ölçüde çalıştırdıktan sonra jeller yol tutuşunu iyileştiren beri jeller cam plakalar sopa eğilimindedir büyük jelleri için cam plakalar Silanizing, tavsiye edilir.

Denatüre üre poliakrilamid jel elektroforezi (Üre-PAGE) yanı sıra, tek iplikli DNA veya RNA parçaları radionucleotide ya da floresan etiketli örnekleri analiz etmek ya da ayırmak için yararlı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma, Singapur Akademik araştırma konseyi (ARC) [hibe sayısı 90/07] tarafından desteklenmiştir. Biz, destek için Radiodurans teşekkür ederiz.

References

  1. Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
  2. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. (2001).
  3. PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. Biorad. (2001).

Comments

7 Comments

  1. Excellent! We are looking for a electrophoresis uniit which can run ²0 cm (W) X ²5 cm (L) denaturing gels. Could you please suggest vendors from who we could purchase those apparatus.

    Dr. Pradeepkumar, IIT Bombay

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2009 - 5:15 AM
  2. Dear Dr. Pradeepkumar,
    You could use the Biorad Sequencing gel system or the adjustable height vertical gel system available from Sigma.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 24, 2009 - 9:07 PM
  3. Sir i am doing denaturing gel for microsatellites. my gel is 40X²0 cm in size. could you tell me the running conditions for the gel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2010 - 3:13 AM
  4. That is awesome. I have an question that PAGE can be used to purify sinlge-stranded DNA pool that I bought from biocompany?
    Thank you!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 20, 2011 - 2:14 PM
  5. Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 9:31 AM
  6. why to prerun the gel in formamide gel electrophoresis for rna

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 4, 2012 - 12:54 AM
  7. Great, Can you suggest me to get a better resolution of Nuclease reaction products on 12% dPAGE, DO i need to run gel at 40 degree environment or like your video at RT ?

    Currently i am running them at RT, but resolution is not crystal clear.

    With regards,

    Reply
    Posted by: kumar v.
    February 26, 2016 - 2:00 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats