Denaturing यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (यूरिया पृष्ठ)

Published 10/29/2009
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Biology

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Summary

Denaturing यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन एकल असहाय डीएनए को अलग करने या 500 nucleotides के एक सीमा के लिए शाही सेना के लिए प्रयोग किया जाता है. गर्मी denatures नमूने और असंरचित एकल किस्में के साथ संयोजन में यूरिया उनके आणविक वजन के अनुसार जेल मैट्रिक्स के भीतर विस्थापित.

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Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE). J. Vis. Exp. (32), e1485, doi:10.3791/1485 (2009).

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Abstract

यूरिया पन्ना या यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing 6-8 एम यूरिया, जो माध्यमिक डीएनए या शाही सेना संरचनाओं denatures और एक polyacrylamide जेल आणविक भार के आधार पर मैट्रिक्स में उनकी जुदाई के लिए प्रयोग किया जाता है रोजगार. 2 से 500 अड्डों के बीच टुकड़े, लंबाई के रूप में एक एकल nucleotide के रूप में छोटे मतभेदों के साथ, इस विधि 1 का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. नमूने के प्रवास चुना acrylamide एकाग्रता पर निर्भर है. Polyacrylamide की एक उच्च प्रतिशत कम आणविक वजन टुकड़े का निराकरण करता है. ° सी जेल चलाने के दौरान यूरिया और 45-55 के तापमान के संयोजन असंरचित डीएनए या शाही सेना अणु की जुदाई के लिए अनुमति देता है.

सामान्य में इस विधि का विश्लेषण करने के लिए या एकल असहाय डीएनए या शाही सेना के टुकड़े, जैसे संश्लेषित या लेबल oligonucleotides या उत्पादों एंजाइमी दरार प्रतिक्रियाओं से शुद्ध की आवश्यकता है.

हम इस वीडियो लेख में बताते हैं कैसे तैयार करने और denaturing यूरिया polyacrylamide जैल चला. तकनीकी सुझावों, मूल प्रोटोकॉल 1,2 करने के लिए इसके अलावा में शामिल हैं.

Protocol

इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए पूर्ण और विस्तृत पाठ प्रोटोकॉल आण्विक जीवविज्ञान में वर्तमान प्रोटोकॉल में उपलब्ध है. जेल सैंडविच की विधानसभा के लिए और जेल तंत्र के लिए विस्तृत कदम दर कदम निर्देश BioRad 3 वेबसाइट पर पाया जा सकता है .

आवश्यक उपकरण:
ग्लास प्लेटें (आंतरिक और बाहरी)
10 सेमी सेल: 10.1 x 7.3 सेमी (आंतरिक प्लेट), 10.1 x 8.2 सेमी (बाहरी थाली) BioRad,
20 सेमी सेल: 20 BioRad x 20 सेमी (आंतरिक प्लेट), 20 x 22.3 सेमी (बाहरी थाली),
0.5-1.5 मिमी जेल कंघी और spacers
जेल कास्टिंग स्टैंड
ढक्कन और केबल के साथ जेल तंत्र
हाई वोल्टेज बिजली की आपूर्ति
ताप ब्लॉक या नहाने के पानी
सीरम विज्ञानी pipettes और पिपेट सहायता
पिपेट और विंदुक युक्तियाँ
जेल ड्रायर या स्कैनर

अभिकर्मकों और समाधान
यूरिया (ultrapure)
40% polyacrylamide समाधान (29:1)
X 10 TBE समाधान (बफर Tris borate, EDTA)
विआयनीकृत, आसुत पानी
TEMED
30% (w / v) अमोनियम persulfate समाधान
0.5 x TBE समाधान
Formamide
EDTA
Xylene cyanol
Bromphenol नीले
मेथनॉल
इथेनॉल

आयतन 50 मिलीलीटर 60 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर
Acrylamide एकाग्रता 10% 12.5% 15% 10% 12.5% 15% 10% 12.5% 15%
ग्राम यूरिया 24 24 24 28.8 28.8 28.8 4.8 4.8 4.8
मिलीलीटर 40% Acryl (29:1) 12.5 15.625 18.75 15 18.75 22.5 2.5 3.125 3.75
उल 30% ए पी एस 166 166 166 199.2 199.2 199.2 33 33 33
उल TEMED 20 20 20 24 24 24 4 4 4
10 एक्स TBE 5 5 5 6 6 6 1 1 1
विआयनीकृत, आसुत जल के साथ मात्रा भरें

तालिका 1: एकल असहाय oligonucleotides हल करने के लिए विभिन्न acrylamide सांद्रता और मात्रा के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और समाधान

जेल सैंडविच विधानसभा और तैयारी जेल

  1. निर्माताओं विवरण के अनुसार जेल इकट्ठा है और जेल कास्टिंग कक्ष 3 में जेल ठीक है. 0.5-1.5 मिमी मोटी spacers का उपयोग करें.
  2. आण्विक जीव विज्ञान में वर्तमान प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त polyacrylamide समाधान तैयार या के रूप में तालिका 1 में सूचीबद्ध है. एक 20 सेमी की denaturing acrylamide जेल के लिए x 22 x 1.5 मिमी सेमी, जेल समाधान के 60 मिलीलीटर और एक 10.1 x 8.2 सेमी के लिए x 1 मिमी जेल 5 मिलीलीटर जेल समाधान के लिए पर्याप्त है. बड़ा जैल जब उम्मीद उत्पादों / बैंड कुछ अड्डों में से एक सीमा के भीतर कर रहे हैं उपयोग किया जाता है, तो एक एकल nucleotide के एक अंतर के साथ एक लंबे समय तक जेल बैंड को हल करेंगे. यदि उम्मीद बैंड 10 से अधिक nucleotides में अलग है, छोटे जैल टुकड़े को हल करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा. Polyacrylamide का प्रतिशत है कि तुम्हारी जुदाई आवश्यकताओं सूट चुनें, एक उच्च polyacrylamide सांद्रता कम आणविक भार टुकड़े को हल करेंगे. Acrylamide का वांछित राशि के साथ ultrapure यूरिया और मिश्रण का प्रयोग करें. जेल मिश्रण TBE बफर जोड़ें 0.5-1 एक्स TBE के अंतिम एकाग्रता और विआयनीकृत, आसुत जल के साथ मात्रा को भरने के लिए. 20 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में समाधान और हीट धीरे मिश्रण. बड़ा जेल संस्करणों इस कदम दोहराएँ जब तक समाधान हाथ गर्म है.
  3. जेल तुरंत एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक और दो गिलास प्लेट के बीच एक स्वचालित विंदुक सहायता का उपयोग कर डालो. हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें. कंघी डालें और 30-60 मिनट के लिए जेल polymerize चलो.

वैद्युतकणसंचलन तंत्र सेट और जेल prerun

  1. कास्टिंग चैम्बर और 3 निर्देश बनाती अनुसार जेल तंत्र को विधानसभा से जेल उतरना.
  2. कम बफर चैम्बर बुद्धि चल रहा है (0.5-1 एक्स TBE) बफर कि गिलास प्लेट उप जाएगा भरेंमर्ज किए गए बफर के साथ 2-3 सेमी. ऊपरी बफर चैम्बर भरें बफर चलाने के साथ जेल के शीर्ष करने के लिए.
  3. ध्यान कंघी को हटाने और एक विंदुक और जेल का उपयोग सुझावों लोड हो रहा है के द्वारा चल रहे बफर के साथ कुओं कुल्ला.
  4. एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति के लिए जेल प्रणाली और केबल में प्लग के ढक्कन संलग्न. इससे पहले कि आप अपने नमूनों को लोड कर सकते हैं आप कम से कम 30 मिनट के लिए जेल prerun जेल गर्मी और जेल से शेष यूरिया को हटाने की है. अधिकतम तापमान 45-55 के बीच होना चाहिए डिग्री सेल्सियस से बचने के 60 से अधिक तापमान डिग्री सेल्सियस के रूप में बैंड धब्बा या गिलास प्लेट दरार सकता है. Prerun (15-25 जेल प्रति डब्ल्यू) के लिए निरंतर वाट चुनें.

नमूना तैयार

  1. बीच में अपने नमूने तैयार. इसलिए, 2 एक्स जेल लोड हो रहा है अपने नमूने के मिश्रण की उचित राशि जोड़ें. लोड हो रहा है मिश्रण आमतौर पर 90% formamide है, 0.5% EDTA, 0.1% xylene cyanol और 0.1% bromphenol नीले रंग शामिल हैं.
  2. इससे पहले नमूने जेल पर लोड किया जा सकता है, नमूने गर्मी 70-90 ° C के बीच कुछ मिनट के लिए नमूने हीटिंग द्वारा विकृत किया जाना चाहिए.

लोड और चलाने जेल

  1. जब prerun समाप्त हो गया है, ढक्कन को हटा दें और अच्छी तरह के रूप में पहले के रूप में यूरिया कुओं में leached है में वर्णित जेब कुल्ला.
  2. जेब से नीचे से नमूने सावधानी से लागू करें. हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें. बफर लोड हो रहा है खाली जेब के लिए लागू किया जा चलाने के दौरान बराबर स्थिति बनाए रखने है.
  3. ढक्कन इकट्ठा और निरंतर वाट जेल चलाने के लिए 55 की एक जेल का तापमान बनाए रखने ° prerun करने के लिए इसी तरह सी. मार्कर रंगों के प्रवास निरीक्षण डाई सामने तक जेल की कम अंत पर पहुंच गया. रन अवधि प्रयुक्त acrylamide का प्रतिशत, बफर और जेल मोटाई के ईओण ताकत पर निर्भर है. एक रन 2-4 घंटे के बीच पिछले कर सकते हैं.
    जेल के तापमान पर जाँच करें. एक जेल थर्मामीटर को चलाने के दौरान सही तापमान पर नजर रखने में मदद कर सकते हैं.

जेल प्रक्रिया

  1. जब डाई सामने जेल के अंत तक पहुँच गया है कम बफर चैम्बर के जेल से बाहर डाल दिया. कक्ष से जेल निकालें और clamps ढीला. दूर spacers खींचो और ध्यान से गिलास प्लेट स्वांग रचना. यदि आवश्यक हो दूर ही जेल हिस्सा युक्त ऊपरी कटौती.
  2. ध्यान से एक डिश में जेल निर्धारण समाधान (TBE अधिक 5-10% मेथनॉल और इथेनॉल का एक ही एकाग्रता) के साथ जेल हस्तांतरण. 5-10 मिनट के लिए समाधान में जेल छोड़ दो और बफर दो बार बदलने के.
  3. जेल आगे प्रसंस्करण के लिए एक वैक्यूम जेल ड्रायर या जेल की प्रत्यक्ष स्कैनिंग का उपयोग कर तैयार है.

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Discussion

  1. बैंड तीखेपन कई कारकों पर निर्भर करता है. नमूना तेज बैंड के लिए लोड की मात्रा के रूप में संभव के रूप में छोटे यानी 1-5 μl के बीच आदर्श होना चाहिए. हालांकि, ऊपर से 15 μl लोड किया जा सकता है जो अभी भी स्वीकार्य संकल्प सुनिश्चित करता है. तेज बैंड में कम नमूना मात्रा परिणाम.
  2. बैंड की गुणवत्ता भी जेल की मोटाई पर निर्भर है. जैसे .75 मिमी पतली जैल, 1.5 मिमी मोटी जैल से बेहतर परिणाम दिखाते हैं.
  3. बैंड के आकार को भी जेल लोड करने के दौरान प्रभावित किया जा सकता है, अगर नमूना जेल जेब में समान रूप से लागू नहीं किया है. लोड हो रहा है बफर में 10% ग्लिसरॉल सहित जेल लोड हो रहा है और अच्छी तरह से अधिक आसानी से में डूब नमूना के दौरान मदद करता है.
  4. एक अन्य संभावित समस्या यह है कि नमूना लोड हो रहा है बफर के साथ जुड़ा हुआ है होते हैं, अगर उम्मीद उत्पाद (ओं) लोड हो रहा रंगों में से एक के रूप में एक ही स्तर पर चलाता है. इसके अलावा, अगर फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग किया जाता है, कुछ रंगों को एक समान तरंगदैर्ध्य पर एक फ्लोरोसेंट संकेत दिखा. यदि यह है कि एक डाई या सभी रंगों को हटाने के मामले में इस समस्या को हल कर सकते हैं. तो यह एक आकार मानक के रूप में एक खाली अच्छी तरह से में डाई युक्त नमूना चलाने के लिए सलाह दी जाती है.
  5. रन की शुरुआत में कम वोल्टेज भी तेज बैंड मिल में मदद करता है, के रूप में नमूना जेल सामने आसानी से प्रवेश करती है और यह है कि जेल जेब उच्च वोल्टेज के कारण पतन से बचा जाता है. एक छोटी कम प्रतिशत जेल stacking acrylamide (4%) एक ही बैंड sharpening प्रभाव हो सकता है.
  6. अक्सर समस्या का सामना करना पड़ा जेल "मुस्कुरा" है, जो वैद्युतकणसंचलन के दौरान जेल के माध्यम से असमान गर्मी वितरण की वजह से है. यदि जेल बफर से घिरा हुआ है, निर्भर करता है जो जेल प्रणाली कार्यरत है, एक धातु की थाली के गिलास प्लेट के लिए संलग्न एक बराबर गर्मी वितरण का समर्थन करता है और काफी हद तक जेल गुणवत्ता बढ़ा सकते हैं.
  7. जैल के लिए बड़ा गिलास प्लेट के Silanizing की सलाह दी है, क्योंकि यह बहुत चलाने के बाद जैल की हैंडलिंग में सुधार, के रूप जैल गिलास प्लेट के लिए छड़ी करने के लिए करते हैं.

Denaturing यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (यूरिया पृष्ठ) विश्लेषण करने के लिए या एकल असहाय डीएनए या शाही सेना के टुकड़े के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूने radionucleotide या फ्लोरोसेंट लेबल अलग करने के लिए उपयोगी है.

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Acknowledgements

यह काम सिंगापुर शैक्षिक अनुसंधान (एआरसी) [अनुदान संख्या 90/07] कौंसिल द्वारा समर्थित किया गया. हम समर्थन के लिए Radiodurans धन्यवाद.

References

  1. Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
  2. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. (2001).
  3. PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. Biorad. (2001).

Comments

7 Comments

  1. Excellent! We are looking for a electrophoresis uniit which can run ²0 cm (W) X ²5 cm (L) denaturing gels. Could you please suggest vendors from who we could purchase those apparatus.

    Dr. Pradeepkumar, IIT Bombay

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2009 - 5:15 AM
  2. Dear Dr. Pradeepkumar,
    You could use the Biorad Sequencing gel system or the adjustable height vertical gel system available from Sigma.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 24, 2009 - 9:07 PM
  3. Sir i am doing denaturing gel for microsatellites. my gel is 40X²0 cm in size. could you tell me the running conditions for the gel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2010 - 3:13 AM
  4. That is awesome. I have an question that PAGE can be used to purify sinlge-stranded DNA pool that I bought from biocompany?
    Thank you!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 20, 2011 - 2:14 PM
  5. Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 9:31 AM
  6. why to prerun the gel in formamide gel electrophoresis for rna

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 4, 2012 - 12:54 AM
  7. Great, Can you suggest me to get a better resolution of Nuclease reaction products on 12% dPAGE, DO i need to run gel at 40 degree environment or like your video at RT ?

    Currently i am running them at RT, but resolution is not crystal clear.

    With regards,

    Reply
    Posted by: kumar v.
    February 26, 2016 - 2:00 PM

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