Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

Published 10/29/2009
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Biology

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Summary

Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동은 단일 좌초 DNA를 분리 또는 500 세포핵의 한계까지 RNA하는 데 사용됩니다. 열 denatures 샘플 및 구조화되지 않은 단일 가닥와 함께 요소는 분자량에 따라 겔 매트릭스 내에서 마이 그 레이션.

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Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE). J. Vis. Exp. (32), e1485, doi:10.3791/1485 (2009).

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Abstract

요소 페이지 또는 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동을 denaturing는 보조 DNA 또는 RNA의 구조를 denatures 및 분자량에 따라 polyacrylamide 젤 매트릭스에서 분리에 사용되는 6-8 M의 요소를 고용합니다. 2-500 기지 사이의 조각은 단일 염기만큼 작은 길이의 차이로이 방법 1을 사용하여 분리 수 있습니다. 샘플의 마이 그 레이션 선택한 아크릴 아미드의 농도에 따라 좌우됩니다. polyacrylamide의 높은 비율의 낮은 분자량 조각을 해결합니다. 요소와 45-55의 온도의 조합 ° C 젤 실행하는 동안 비정형 DNA 또는 RNA 분자의 분리 수 있습니다.

일반적으로이 방법은 단일 좌초된 DNA 또는 효소 절단 반응에서 합성 또는 분류 oligonucleotides 또는 제품으로 RNA 조각을 분석하거나 정화가 필요합니다.

이 비디오를 문서에서 우리는 denaturing 요소의 polyacrylamide의 젤류을 준비하고 실행하는 방법을 보여줍니다. 기술 팁은 원래 프로토콜 1,2 이외에 포함되어 있습니다.

Protocol

이 실험 절차에 대한 완전하고 상세한 텍스트 프로토콜은 분자 생물학의 현재 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 겔 샌드위치의 조립 및 겔 장치에 대한 자세한 단계별 지침은 BioRad 웹사이트 3 확인할 수 있습니다.

필수 장비 :
유리 접시 (내부 및 외부)
10cm 셀 : 10.1 X 7.3 cm (내부 판), 10.1 X 8.2 cm (외부 판), BioRad
20cm 셀 : 20 X 20cm (내부 판), 20 X 22.3 cm (외부 판), BioRad
0.5-1.5 mm 겔 빗과 스페이서
겔 주조 스탠드
덮개와 케이블로 젤 장치
고전압 전원 공급 장치
난방 장치 블록이나 물 목욕
Serological pipettes 및 피펫 에이드
피펫 및 피펫 팁
겔 건조기 스캐너

시약 및 솔루션 :
요소 (ultrapure)
40 % polyacrylamide 솔루션 (29:1)
10 × TBE 솔루션 (트리스 - Borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼)
Deionized, 증류수
TEMED
30 % (W / V) 암모늄 persulfate 솔루션
0.5 X TBE 솔루션
포름 아미드
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
크실렌 cyanol
Bromphenol 블루
메탄올
에탄올

음량 50 ML 60 ML 10 ML
아크릴 아미드 농도 10% 12.5 % 15% 10% 12.5 % 15% 10% 12.5 % 15%
g 요소 24 24 24 28.8 28.8 28.8 4.8 4.8 4.8
ML 40% 아크릴 (29:1) 12.5 15.625 18.75 15 18.75 22.5 2.5 3.125 3.75
UL 30 % APS 166 166 166 199.2 199.2 199.2 33 33 33
UL TEMED 20 20 20 24 24 24 4 4 4
10 × TBE 5 5 5 6 6 6 1 1 1
deionized, 증류수로 볼륨을 채워

표 1 : 단일 좌초 oligonucleotides를 해결하기위한 다양한 아크릴 아미드의 농도와 볼륨에 필요한 시약 및 솔루션

겔 샌드위치 어셈블리 및 젤 준비

  1. 제조 업체의 설명에 따라 겔 조립 및 겔 - 캐스팅 챔버 3 겔을 수정. 0.5-1.5 mm 두께 스페이서를 사용합니다.
  2. 분자 생물학의 현재 프로토콜에 따라 적절한 polyacrylamide 솔루션을 준비하거나 표 1에 나열. 20cm의 denaturing 아크릴 아미드 젤에 대한 X 22cm X 1.5 mm, 젤 솔루션 60 ML과 10.1 X 8.2 cm에 대한 X 1mm 겔 5 ML 젤 솔루션은 충분합니다. 예상 제품 / 밴드 몇 기지의 범위 내에있는 경우 큰 젤을 사용하는 다음, 더 이상 젤는 단일 염기의 차이로 밴드를 해결할 수 있습니다. 예상 밴드는 10 개 이상의 세포핵에 차이가있다면, 작은 젤은 조각을 해결하기 위해 적합한 것입니다. 귀하의 분리 요구 사항을 맞는 polyacrylamide의 비율을 선택, 높은 polyacrylamide의 농도는 낮은 분자량의 조각을 해결할 수 있습니다. 아크릴 아미드의 원하는 양의 ultrapure의 요소와 믹스를 사용합니다. 0.5-1 X TBE의 최종 농도를하고 deionized, 증류수로 볼륨을 채울 수있는 겔 믹스에 TBE 버퍼를 추가합니다. 전자렌지에 20 초 동안 솔루션을 가열하고 그것을 부드럽게 섞는다. 솔루션 손이 따뜻한 때까지 큰 겔 볼륨이 단계를 반복하십시오.
  3. 즉시 serological 피펫과 두 개의 유리 판 사이에 자동 피펫 에이드를 사용하여 겔 하거라. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 빗를 삽입하고 젤 30-60분을위한 중합 보자.

전기 영동 장치를 설정하고 젤 prerun

  1. 지침 3 제조에 따라 주조 챔버와 겔 장치에 어셈블리를에서 젤 분리합니다.
  2. 유리 플레이트가 서브됩니다 낮은 버퍼 챔버 재치 실행 버퍼 (0.5-1 X TBE) 작성버퍼 2~3cm을 통합. 버퍼를 실행하는 젤의 맨 위쪽 버퍼 챔버를 입력합니다.
  3. 조심스럽게 빗를 제거하고 도움말을 읽어 피펫 및 젤을 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어.
  4. 고전압 전원 공급 장치에 케이블에서 겔 시스템 및 플러그의 뚜껑을 연결합니다. 당신이 샘플을 로드할 수 있습니다 전에 젤을 가열하고 젤 남아 요소를 제거하려면 최소 30 분 동안 젤 prerun해야합니다. 최적 온도는 45-55 사이 여야합니다 ° C. 60보다 높은 온도 ° C 밴드는 얼룩이나 유리 조각이 균열있을 수 있으므로.을 피하십시오 prerun (겔 당 15-25 W)에 대한 지속적인 와트를 선택합니다.

샘플 준비

  1. 그 동안에 샘플을 준비합니다. 따라서, 샘플 2 X 젤 로딩 믹스의 해당 금액을 추가합니다. 로딩 혼합은 일반적으로 90 % 포름 아미드, 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 크실렌 cyanol와 0.1 % bromphenol 파란색이 포함되어 있습니다.
  2. 샘플이 젤에로드하기 전에 샘플을 몇 분 동안 70-90 ° C 사이의 샘플을 가열하여 열기가 변성해야합니다.

젤로드 및 실행

  1. prerun가 완료되면 뚜껑을 제거하고 완전히 같은 요소가 우물에 leached 것처럼 언급한 주머니를 씻어.
  2. 주머니 바닥에서 신중하게 샘플을 적용합니다. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 버퍼를 로딩하면 실행되는 동안 같은 상태를 유지하기 위해 빈 주머니에 적용되어야합니다.
  3. 뚜껑을 조립하고 55 젤 온도를 유지하기 위해 지속적인 와트에서 젤을 실행 ° C prerun과 유사합니다. 염료 앞에는 젤의 하단에 도달 때까지 마커 염료의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 운영 기간은 사용되는 아크릴 아미드의 비율, 버퍼와 겔 두께의 이온 강도에 따라 좌우됩니다. 실행 2-4시간 사이에 마지막으로하실 수 있습니다.
    젤의 온도를 확인합니다. 겔 온도계가 실행되는 동안 적당한 온도를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

젤 공정

  1. 염료 앞에는 젤의 끝에 도달하면 낮은 버퍼 챔버의 겔을 넣어. 챔버에서 젤을 제거하고 클램프를 느슨하게. 스페이서 멀리 당겨 조심스럽게 유리 접시를 감추고 있기도 하죠. 필요한 잘 겔 부분을 포함하고있는 상위 버려야하는 경우.
  2. 조심스럽게 겔 고정 솔루션 (TBE 플러스 5-10%의 메탄올과 에탄올의 농도가 동일)와 함께 접시에 젤을 전송하기만하면됩니다. 50~10분위한 솔루션으로 젤두고 버퍼를 두 번 변경할 수 있습니다.
  3. 젤은 진공 겔 건조기 또는 젤 직접 스캔을 사용하여 추가 처리를위한 준비가되었습니다.

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Discussion

  1. 밴드 날카로움은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 선명한 밴드를위한로드 샘플의 볼륨 즉, 이상적으로 1-5 μl 사이에 가능한 작게해야합니다. 그러나, 최대 15 μl 여전히 허용 해상도를 보장하는 로드할 수 있습니다. 선명 밴드의 적은 샘플 량 결과.
  2. 밴드 품질 또한 겔의 두께에 따라 좌우됩니다. 같은 0.75 mm로 얇은 젤은, 1.5 mm 두께 젤보다 더 나은 결과를 보여줍니다.
  3. 샘플은 겔 주머니에 동일하게 적용되지 않은 경우 밴드의 모양도, 젤 로딩하는 동안 영향을받을 수 있습니다. 로딩 버퍼에 10 % 글리세롤을 포함하는 것은 물론 더 쉽게로 겔로드 및 샘플 싱크하는 동안 도움이됩니다.
  4. 예상 제품 (들)가 로딩 염료 중 하나와 같은 수준에서 실행하면 샘플 로딩 버퍼와 연결되어있는 또 다른 잠재적인 문제가 발생할 수 있습니다. 또한, 형광 라벨을 사용하는 경우, 일부 염료는 비슷한 파장에서 형광 신호를 보여줍니다. 이 경우 한 염료 또는 모든 염료를 제거하는 경우이 문제를 해결할 수 있습니다. 그렇다면 그것은 크기의 표준으로 빈 우물에 염료가 포함된 예제를 실행하는 것이 좋습니다.
  5. 샘플이 원활 젤 앞에를 입력하고 높은 전압으로 인해 해당 겔 주머니의 붕괴를 피할 수로 실행의 시작 부분에서 낮은 전압도 선명 밴드를 얻을 수 있도록 도와줍니다. 젤 스태킹 짧은 낮은 비율 아크릴 아미드 (4 %)은 동일한 대역 선명하게 영향을 미칠 수 있습니다.
  6. 자주 발생 문제가 젤 전기 영동 중에 젤을 통해 고르지 열 분포로 인해하는 "미소"입니다. 젤이 버퍼로 둘러싸여 있지 않다면, 유리 접시에 금속 접시의 부착, 젤 시스템이 고용하는 것은 따라 등열분포을 지원하고 실질적으로 젤 품질을 높일 수 있습니다.
  7. 그것이 크게 실행한 후 젤의 처리를 개선 이후 젤은 유리 접시에 집중하는 경향으로 큰 젤 유리 플레이트의 Silanizing는, 좋습니다.

Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)는 단일 좌초된 DNA 또는 RNA 조각뿐만 아니라 radionucleotide 또는 형광 - 라벨 샘플을 분석하거나 분리하는 데 유용합니다.

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Acknowledgements

이 작품은 싱가포르 학술 연구위원회 (ARC) [부여 번호 90/07]에 의해 지원되었다. 우리는 지원 Radiodurans 감사합니다.

References

  1. Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
  2. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. (2001).
  3. PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. Biorad. (2001).

Comments

7 Comments

  1. Excellent! We are looking for a electrophoresis uniit which can run ²0 cm (W) X ²5 cm (L) denaturing gels. Could you please suggest vendors from who we could purchase those apparatus.

    Dr. Pradeepkumar, IIT Bombay

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2009 - 5:15 AM
  2. Dear Dr. Pradeepkumar,
    You could use the Biorad Sequencing gel system or the adjustable height vertical gel system available from Sigma.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 24, 2009 - 9:07 PM
  3. Sir i am doing denaturing gel for microsatellites. my gel is 40X²0 cm in size. could you tell me the running conditions for the gel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2010 - 3:13 AM
  4. That is awesome. I have an question that PAGE can be used to purify sinlge-stranded DNA pool that I bought from biocompany?
    Thank you!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 20, 2011 - 2:14 PM
  5. Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 9:31 AM
  6. why to prerun the gel in formamide gel electrophoresis for rna

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 4, 2012 - 12:54 AM
  7. Great, Can you suggest me to get a better resolution of Nuclease reaction products on 12% dPAGE, DO i need to run gel at 40 degree environment or like your video at RT ?

    Currently i am running them at RT, but resolution is not crystal clear.

    With regards,

    Reply
    Posted by: kumar v.
    February 26, 2016 - 2:00 PM

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