분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

Biology

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Summary

내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다.

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Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).

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Abstract

본 논문은 heparinized에서 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)에 대한 새로운 복구 전략을 도입하지만, 그렇지 12일의 의미 이내에 성인 인간의 말초 혈액을 unmanipulated. 대규모 확장 후> 1x10 8 ECFCs는 추가적인 테스트를 위해 얻을 수 있습니다. Advantageously pHPL를 사용하여 소 혈청 항원과 인간 세포의 접촉은 제외시킬 수 있습니다. 유동세포계측법 및 immunohistochemistry으로 분리된 세포는 ECFC 및 체외 기능의 구조와 같은 혈관을 형성하는가 matrigel 분석에서 테스트 수있는 특징 수 있습니다. 또한이 세포는 생체내 subcutaneously에 기능, perfused 혈관을 형성하는 마우스 모델에서 주입 수 있습니다. 장기 확장 및 cryopreservation 확산 후, 기능 및 게놈의 안정성은 화석이 보존 되기에 나타납니다. 3,4가

이것은 동물 단백질 무료로 절연 및 확장 방법은 ECFCs 대량를 생성하기 위해 쉽게 적용됩니다.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON

DAY 1 :

  1. 당신이 시작하기 전에 실험은 세포 배양 매체 내피 성장 중간 2 (EGM - 2)를 준비합니다. (; 모든 시그마, 세인트 루이스, MO 500ml 내피 기초 헤파린 (1000 U / ML의 1ml)로 중간 2 페니실린 / 스트렙토 마이신의 5ml 100x 솔루션을 보완 www.sigmaaldrich.com ), L - 글루타민 (2 MM 최종 농도 ) 50 ML 풀링된 인간의 혈소판의 lysate (pHPL). ; 다음 0.2 ML의 하이드로코티손, 2 ML hFGF - B, 0.5 ML VEGF, 0.5 ML EGF, 0.5 ML IGF - 1과 0.5 ML의 아스코르비 산 (SingleQuots로 제공, 모든 Lonza, 워커스빌, MD 추가 http://www.lonzabioscience.을 COM / ). 무균 여과액 0.2 m - 기공 크기의 500 ML Millipore 진공 필터를 통해 중간. pHPL 작은 혈전을 형성하고 있기 때문에 하나의 매체의 두 가지 필터가 필요할 수 있습니다. 사전 따뜻한 필터링 EGM - 2 37 ° C 물 목욕으로
  2. 6ml 방부제 무료 나트륨 - 헤파린 혈액 vacutainer 관에 cubital 정맥에서 어른이 인간의 말초 혈액의 5 ML를 그림으로써 혈액 샘플을 수집합니다. 당신은 2 시간 최대 내에서 혈액 샘플을 처리한다.
  3. 통풍 모자, 한 25 ML의 피펫과 층류 벤치에 두 5 ML pipettes와 플라스크, 한 75cm 2 (코스타 T75) 준비하여 시작하십시오.
  4. 사전 채우기 15 ML 사전 예열 25 ML의 피펫으로 플라스크에 EGM - 2 보충. 이제 혈액 약병 및 샘플 술병에 5 ML의 피펫과 함께 모든 5 ML을 엽니다. 두 번째 5 ML의 피펫과 함께 추가 EGM - 2 5 ML과 빈 혈액 병을 린스. T75 내에서 총 판매량은 25 ML이다. 37 인큐베이터에있는 술병과 장소의 통풍 - 뚜껑을 닫기 ° C 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도.

DAY 2 :

  1. 약 24 시간 (야간 이상) 후 비 점착 성의 세포의 제거에 대한 중간 혈액 혼합물을 제거합니다. 층류 흐름에 준비이 25 ML pipettes 세 5 ML pipettes 경우, 사전 따뜻한 20 ML ° C 물 목욕에 37 EGM - 2 (전날에 준비) 30 ML PBS를 보충.
  2. 인큐베이터에서 샘플로 술병을 제거하고 25 ML의 피펫 모든 뜨는을 제거합니다. 어떤 잠재적인 식민지 손상을 방지하기 위해 술병의 표면을 스크래치 않도록주의를 가져가라. 부드럽게 다른 한쪽에서 미리 예열 PBS 및 틸팅 술병 10 ML을 추가하여 내부 술병 세포 부착 표면에 세 번 씻으십시오. PBS 즉시 각 시간과 폐기를 제거합니다.
  3. 플라스크에 신선한 사전 예열 EGM - 2 20 ML를 추가하고 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 과정은 분리하지 연결된 세포에 대한 신속하고 최대한 부드럽게으로 수행되어야합니다. 그들이 오래 위해 PBS 또는 상온에서 보관하는 경우 ECFCs 쉽게 분리합니다.
  4. 술병을 통해 화면 systemically 매초마다 하루 ECFC 파생물을 찾고 가벼운 현미경의 낮은 배율을 사용하여 하루에 두세에서 시작. 식민지는 식민지의 위치를​​ 나타내는 술병의 바깥 쪽 상단에있는 마크를 발견하는 것입니다. flaks 이상 5 분 인큐베이터 밖되지해야합니다.

DAY 5 :

  1. 5 일 시딩 이후 비 점착 성의 세포를 제거하는 완벽한 매체 변경을 수행합니다. 사전 따뜻한 20 ML 이러한 목적 EGM - 2 37 ° C 물 목욕으로 두 25 ML pipettes 준비.
  2. 25 ML의 피펫을 사용하여 완전한 매체를 제거하고 가능한 빨리 신선한 사전 예열 보충 EGM - 2를 추가합니다. 전지는 건조하지 않도록 분 이상 매체없이 왼쪽해서는 안됩니다. 인큐베이터에 다시 플레이스와 매일 술병을 검사 반복합니다.
  3. 신선한 보충 EGM - 2 회 주간의 중간의 30 %를 교체하여 세포를 공급.

DAY 14-28 :

  1. 코블 스톤의 형태로 전형적인 식민지는 하루에 1,200 나타납니다. 각 식민지의 위치를​​ 나타내기 위해 술병의 맨 바깥쪽 면을 표시한다. 단일 세포 분리 시작하지 않는 한 식민지가 하루 28까지 성장할 수 있습니다. 일단, 기본 식민지들은 그들의 크기에 따라 일 14 28 사이에 수확한 수 확인되었습니다.

B.) ECFC 하베스트

  1. 사전 따뜻한 5 ML 트립신 0.05 % / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 ML PBS 및 5ml 신선한 보충 EGM - 2.
  2. 완전히 (잠재적인 식민지 손상을 방지하기 위해 술병의 표면을 만지지 않도록 돌봐) 팔콘 튜브에 술병에서 매체를 제거하고 10 ML preheated PBS로 세포를 신중하게 씻으십시오.
  3. 인큐베이터 5 분 5 ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화를 추가합니다. 그것이 독성되는 이후 세포는 7 개 이상의 분 트립신에 노출해서는 안됩니다. 철저하게 플라스크의 측면을 감청하는 것은 세포를 분리하는 데 도움이됩니다. 보존된 사용하는 문화 매체의 약 10 ML을 추가하여 트립신 프로 테아제 활동을 끄다.
  4. 50 ML 팔코에 세포 현탁액을 제거N 튜브. 이후 수확 세포 현탁액에 추가되면 10 ML PBS로 술병을 씻으십시오. 4 7 분에 대한 300g에 세포 현탁액을 원심 분리기 ° C는 세포를 수집하고 트립신을 제거합니다. 뜨는을 취소하고 1 ML PBS에서 즉시 세포 펠렛을 resuspend. 얼음 계속.
  5. R. 리카르도와 K. Phelani하여 조브 프로토콜에서 설명한대로 휴대폰 번호를 결정 5.

C.) ECFC 확장

  1. 보충 500 ML EGM - 2 등) 1.1에서 설명했다. 37 사전 따뜻한 ° C 물 목욕 인치
  2. Nunc, 네이퍼빌, IL,, 약 2,500cm이 문화 공간 11 T220 (225cm 2) 15 T175 (175cm 2) 또는 하나에 안경 계층 세포 공장 (CF - 4 준비 http://www.nuncbrand . com ). 또한 두 개의 새로운 통풍구 - 모자와 층류 벤치에서 특별한 살균 깔때기가 필요합니다.
  3. 100 시작 세포 밀도의 씨앗 ECFCs에 휴대폰 번호의 C / cm 2 계산이 필요합니다. 한 CF - 4 252,800 전지 500 ML 신선한 EGM - 2 resuspended되고 멸균 깔때기를 사용하여 CF - 4에 부어. 환기 - 모자 하나의 통풍구를 닫고 모든 4 밀가루 사이에 매체의 평등한 분배를 가능하게 CF - 4 한 경도 측면을 기울. 다음 챔버를 뒤로 기울이기 및 통풍 - 캡의 뚜껑을 엽니다. 인큐베이터에서 CF - 4를 놓습니다.
  4. CF - 4까지 적어도 한번 매주 매체의 20 %를 변경 합류합니다.
  5. 수확 세포는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 70 ML과 약 200 ML PBS를 사용하여) B.에 설명되어.

대표 결과

이 격리 방법을 사용하여 우리는 하루에 12 주 콜로니 형성을 관찰했다. 이전 연구에서는 4.0 ± 의미 말초혈 각 ML에서 파생된 0,8 ECFC - 식민지를 복구할 수있었습니다. 4 ECFCs는 일반 코블 스톤의 모습을 보여주었다. 대규모 확장 후, 100 세포 / cm 2 시딩 밀도, 우리 3 남 1 여성 자원 봉사자 (26 ~ 50 세 사이의 연령)에서 약 30 일의 총> 1 X 10 8 세포를 획득하였습니다.

이러한 조건 하에서 교양 ECFC은 proliferative 기능 및 genomically 안정 표시되었습니다. 4 나아가 세포가 추가로 사용하기 위해 액체 질소로 (10 % DMSO)를 저장할 수 있습니다. 3,4

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Discussion

이 소설 절연 및 확장 방법이 더 효율적이고 더 적은 시간이 소요 모든 세포 분리합니다 (밀도 기울기가 필요 없습니다)을 피함으로써과 기존 기술보다 비싸 간단하고 효율적인 프로세스입니다. 보빈 항원과 putative 이후 xenoimmunization에 pHPL 연락처를 사용하여 제외됩니다. 문화 기간 동안 작은 혈전이 pHPL에 의한, 양식 수 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로 이러한 혈전은 콜로니 형성과 세포 증식이나 기능에 영향을하지 않습니다.

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Acknowledgments

저자는 훌륭한 기술 지원 pHPL와 Margaretha Frühwirth와 다니엘라 탈러를 제공 박사 Katharina Schallmoser 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endothelial basal Medium-2 Lonza Inc. 500ml
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin Biochrom AG 10U/ml per EGM-2
L-Glutamine Sigma-Aldrich 2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin Sigma-Aldrich 100U/mL Penicillin and
100μg/mL Streptomycin per
EGM-2
Trypsin/1mM EDTA Invitrogen 7ml for T75 flask
70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4) Corning
Sterile Funnel Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap) Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) BD Biosciences preloaded with 108 IU/6ml of
preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes Falcon BD
5ml Stripetts Costar
25ml Stripetts Costar
Squeezer Costar
0,2 pore size sterile filter EMD Millipore 2x 500ml per EGM-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
  2. Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  3. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
  4. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
  5. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).

Comments

3 Comments

  1. We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
    Diana

    Reply
    Posted by: Diana P.
    March 26, 2010 - 12:58 PM
  2. Hi Diana,

    We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.

    Micheline

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2010 - 2:27 PM
  3. Hi Micheline
    Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.

    Reply
    Posted by: he f.
    July 19, 2011 - 8:42 AM

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