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Summary
Endothelial कॉलोनी बनाने के पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (ECFCs) संवहनी homeostasis और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण हैं.
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Copy Citation | Download Citations | Reprints and PermissionsHofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).
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Abstract
इस कागज endothelial कॉलोनी बनाने heparinized से पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (ECFCs) के लिए एक उपन्यास वसूली की रणनीति का परिचय है, लेकिन अन्यथा 12 दिनों का एक मतलब के भीतर वयस्क मानव परिधीय रक्त unmanipulated. बड़े पैमाने पर विस्तार के बाद> 1x10 8 ECFCs आगे के परीक्षण के लिए प्राप्त किया जा सकता है. Advantageously pHPL का उपयोग करके गोजातीय सीरम प्रतिजनों के साथ मानव कोशिकाओं के संपर्क को बाहर किया जा सकता है. प्रवाह cytometry और immunohistochemistry द्वारा अलग कक्षों ECFC और इन विट्रो कार्यक्षमता में उनकी संरचनाओं की तरह संवहनी फार्म एक matrigel परख में परीक्षण किया जा सकता है के रूप में लक्षण वर्णन किया जा सकता है. इसके अलावा इन कोशिकाओं subcutaneously एक माउस मॉडल में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है vivo में कार्यात्मक, perfused वाहिकाओं के रूप में. लंबी अवधि के विस्तार और cryopreservation के प्रसार के बाद, समारोह और जीनोमिक स्थिरता के लिए संरक्षित किया जा दिखाई 3,4 .
यह पशु प्रोटीन मुक्त अलगाव और विस्तार विधि आसानी ECFCs की एक बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के लिए लागू होता है.
Protocol
ए) ECFC ISOLATON
1 दिन:
- इससे पहले कि आप के साथ शुरू प्रयोग सेल संस्कृति माध्यम endothelial वृद्धि मध्यम 2 (ईजीएम-2) तैयार है. (सभी सिग्मा, सेंट लुइस, MO 500ml Endothelial बेसल हेपरिन (1000 यू / एमएल 1ml) के साथ 2 मध्यम, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5ml 100x समाधान अनुपूरक www.sigmaaldrich.com), एल glutamine (2 मिमी अंतिम एकाग्रता ), और 50 मिलीलीटर जमा मानव प्लेटलेट lysate (pHPL). , फिर 0.2 मिलीलीटर hydrocortisone, 2 मिलीलीटर hFGF बी, 0.5 मिलीलीटर VEGF, 0.5 मिलीलीटर EGF, 0.5 मिलीलीटर IGF-1 और 0.5 मिलीलीटर ascorbic एसिड (SingleQuots के रूप में प्रदान, सभी Lonza, Walkersville, एमडी जोड़ने http://www.lonzabioscience. com / ). बाँझ छानना एक 0.2 मीटर ताकना आकार 500 मिलीलीटर Millipore वैक्यूम फिल्टर के माध्यम माध्यम है. चूंकि pHPL छोटे थक्के रूपों तुम एक माध्यम के लिए दो फिल्टर की आवश्यकता हो सकती है. पूर्व गर्म फ़िल्टर्ड ईजीएम 2 37 डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में
- Cubital नस से एक 6ml परिरक्षक मुक्त सोडियम हेपरिन रक्त vacutainer ट्यूब में वयस्क मानव परिधीय रक्त के 5 मिलीलीटर ड्राइंग द्वारा रक्त के नमूने ले लीजिए. आप दो घंटे की एक अधिकतम के भीतर रक्त के नमूनों की प्रक्रिया चाहिए.
- दिए टोपी, एक 25 मिलीलीटर विंदुक और दो एक लामिना का प्रवाह बेंच में 5 मिलीलीटर pipettes के साथ फ्लास्क, एक 75 सेमी (2 costar T75) की तैयारी द्वारा शुरू करो.
- पूर्व भरने के 15 मिलीलीटर पूर्व गर्म फ्लास्क में 25 मिलीलीटर विंदुक के साथ ईजीएम-2 पूरक. अब रक्त शीशी और फ्लास्क में 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ सभी 5 मिलीलीटर नमूना खुला. दूसरा 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ 5 मिलीलीटर अतिरिक्त ईजीएम-2 के साथ खाली रक्त शीशी कुल्ला. T75 के भीतर कुल मात्रा 25 मिलीलीटर है. 37 में कुप्पी और एक मशीन में जगह दिए टोपी बंद ° सी, 5% सीओ 2 और 24 घंटे के लिए 95% की नमी.
दिन 2:
- लगभग 24 घंटे (रात से अधिक) के बाद आप मध्यम खून मिश्रण को दूर करने के लिए गैर पक्षपाती कोशिकाओं से छुटकारा मिलना चाहिए. इस तैयार दो 25 मिलीलीटर और लामिना का प्रवाह में pipettes तीन 5 मिलीलीटर pipettes के लिए, पूर्व गर्म 20 मिलीलीटर की 37 ° C एक पानी के स्नान में (पिछले दिन पर तैयार) ईजीएम-2 और 30 मिलीलीटर पीबीएस पूरक.
- नमूने के साथ इनक्यूबेटर से फ्लास्क और निकालें एक 25 मिलीलीटर विंदुक के साथ सभी सतह पर तैरनेवाला हटायें. फ्लास्क सतह खरोंच नहीं के लिए किसी भी संभावित कॉलोनी हानिकारक से बचने के ख्याल रखना. भीतर फ्लास्क सेल पालन सतह धीरे एक पक्ष से दूसरे को पूर्व गर्म पीबीएस और झुकने फ्लास्क के 10 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा तीन बार धोएं. तुरंत हर बार और त्यागें पीबीएस निकालें.
- कुप्पी के ताजा पूर्व गर्म ईजीएम - 2 के 20 मिलीलीटर जोड़ें और इसे इनक्यूबेटर में वापस जगह है. इस प्रक्रिया में संलग्न कोशिकाओं को नहीं अलग के लिए तेजी से और संभव के रूप में कोमल के रूप में किया जाना चाहिए. ECFCs आसानी से अलग अगर वे पीबीएस में या कमरे के तापमान पर लंबे समय के लिए के लिए रखा जाता है.
- कुप्पी के माध्यम से प्रणालीबद्ध हर दूसरे दिन दो दिन में स्क्रीन एक प्रकाश ECFC परिणाम के लिए देख सूक्ष्मदर्शी की एक कम बढ़ाई शुरू का उपयोग कर. जब एक कॉलोनी कॉलोनी की स्थिति का संकेत फ्लास्क के बाहरी पक्ष में शीर्ष पर निशान पाया गया है. ध्यान दें कि flaks इनक्यूबेटर के बाहर अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए नहीं होना चाहिए.
5 दिन:
- बोने के बाद पांचवें दिन एक पूरा मध्यम गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने परिवर्तन करते हैं. इस पूर्व गर्म 20 मिलीलीटर के प्रयोजन के लिए ईजीएम - 2 से 37 डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में और दो 25 मिलीलीटर pipettes तैयार.
- पूरा माध्यम का उपयोग कर एक 25 मिलीलीटर विंदुक निकालें और ताजा, पूर्व गर्म पूरक ईजीएम 2 जोड़ने के रूप में के रूप में जल्द से जल्द. कक्ष को सुखाने से बचने के लिए एक मिनट से भी अधिक के लिए माध्यम के बिना नहीं छोड़ा जाना चाहिए. इनक्यूबेटर में वापस प्लेस और कुप्पी दैनिक स्क्रीनिंग दोहराने.
- ताजा पूरक ईजीएम-2 है दो बार साप्ताहिक द्वारा मध्यम के 30% की जगह द्वारा कोशिकाओं फ़ीड.
14-28 दिवस:
- पक्की सड़क पत्थर आकारिकी साथ ठेठ कालोनियों के 12 दिन के आसपास दिखाई देनी चाहिए. कुप्पी के ऊपर बाहर की ओर मार्क प्रत्येक कॉलोनी की स्थिति का संकेत है. कालोनियों के 28 दिन तक विकसित करने के लिए जब तक एकल कक्षों अलग शुरू की अनुमति दें. एक बार, प्राथमिक कालोनियों की पहचान की गई है कि वे 14 दिन और 28 के बीच काटा जा सकता है है उनके आकार के आधार पर.
बी) ECFC फसल
- पूर्व गर्म 5 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA, 20 मिलीलीटर पीबीएस और 5ml ताजा पूरक ईजीएम-2.
- पूरी तरह से कुप्पी से एक फाल्कन ट्यूब में मध्यम (फ्लास्क के लिए किसी भी संभावित कॉलोनी हानिकारक से बचने के सतह को स्पर्श नहीं ख्याल रखना) को हटाने और कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर preheated पीबीएस के साथ सावधानी से धो.
- इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 5 मिलीलीटर trypsin / EDTA और सेते जोड़ें. कोशिकाओं trypsin के लिए अधिक से अधिक 7 मिनट के लिए उजागर नहीं हो सकता है क्योंकि यह विषाक्त हो जाता है चाहिए. कुप्पी की अच्छी तरह से दोहन पक्षों कोशिकाओं को अलग करने में मदद करता है. संरक्षित इस्तेमाल किया मध्यम संस्कृति के लगभग 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin protease गतिविधि बुझाने.
- एक 50 मिलीलीटर Falco में सेल निलंबन निकालेंपता ट्यूब. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार फ्लास्क है जो उसके बाद काटा सेल निलंबन के लिए जोड़ा जाता है धोएं. 300 ग्राम में 4 पर 7 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए और trypsin हटायें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सेल गोली 1 मिलीलीटर पीबीएस में तुरंत resuspend. बर्फ पर रखें.
- सेल नंबर निर्धारित के रूप में आर रिकार्डो और लालकृष्ण Phelani द्वारा एक जौव प्रोटोकॉल में वर्णित 5.
सी.) ECFC विस्तार
- अनुपूरक 500 मिलीलीटर ईजीएम-2 के रूप में एक 1.1 में वर्णित). पूर्व से 37 तक गर्म डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में.
- Nunc, Naperville, आईएल, लगभग 2500 सेमी 2 संस्कृति अंतरिक्ष के लिए एक T220 या तो 11 (225 2 सेमी) या 15 T175 (175 2 सेमी) या एक चार स्तरित सेल कारखाना (CF-4 तैयार http://www.nuncbrand कॉम. ). इसके अतिरिक्त आप दो ताजा वेंट - कैप और लामिना का प्रवाह बेंच में एक विशेष बाँझ कीप की आवश्यकता होगी.
- एक प्रारंभिक 100 की सेल घनत्व में बीज ECFCs ग / सेमी 2 के सेल नंबर गणना आवश्यक है. एक के लिए 500 मिलीलीटर ताजा ईजीएम-2 में सीएफ़ - 4 252,800 कोशिकाओं resuspended हैं और सीएफ़ - 4 में डाला बाँझ कीप का उपयोग. एक वेंट वेंट टोपी के साथ बंद करें और CF-4 के लिए एक देशांतर की ओर झुकाव, सभी 4 flours के बीच माध्यम का एक समान वितरण को सक्षम करने. फिर चैम्बर वापस झुकाव और वेंट टोपी के ढक्कन खुला. इनक्यूबेटर में सीएफ़ - 4 रखें.
- कम से कम एक बार सीएफ़ - 4 तक साप्ताहिक माध्यम के 20% बदलें मिला हुआ है.
- हार्वेस्ट कोशिकाओं के रूप में बी में trypsin / EDTA के 70 मिलीग्राम और लगभग 200 मिलीलीटर पीबीएस का उपयोग करके) में वर्णित है.
प्रतिनिधि परिणामों
इस अलगाव पद्धति का उपयोग करके हम 12 दिन में एक प्राथमिक कॉलोनी गठन मनाया. पिछले एक अध्ययन में 4.0 का एक मतलब ± 0,8 परिधीय रक्त की प्रत्येक मिलीलीटर से व्युत्पन्न ECFC कालोनियों को ठीक करने में सक्षम थे 4 ECFCs. एक ठेठ पक्की सड़क पत्थर उपस्थिति से पता चला है. बड़े पैमाने पर विस्तार के बाद, कोशिकाओं 100 / 2 सेमी की एक बोने घनत्व के साथ, हम 3 पुरुष और एक महिला स्वयंसेवकों (26 और 50 साल के बीच उम्र) से लगभग 30 दिनों के कुल में> x 10 8 कोशिकाओं 1 प्राप्त.
इन शर्तों के तहत सुसंस्कृत ECFC proliferative, कार्यात्मक और genomically स्थिर होना दिखाया गया है इसके अलावा 4 कोशिकाओं को आगे उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में (10% DMSO में) संग्रहीत कर सकते हैं. 3,4
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Discussion
इस उपन्यास अलगाव और विस्तार विधि एक सरल और कुशल प्रक्रिया है कि और अधिक कुशल और कम समय खपत और किसी भी सेल जुदाई कोई घनत्व ढाल की जरूरत से बचने के द्वारा परम्परागत तकनीकों की तुलना में कम खर्चीला है. गोजातीय प्रतिजनों और ख्यात बाद xenoimmunization pHPL संपर्क का उपयोग करके बाहर रखा गया है. संस्कृति की अवधि के दौरान छोटे थक्के फार्म, pHPL की वजह से कर सकते हैं. हमारे अनुभव के आधार पर इन थक्के कॉलोनी गठन और सेल प्रसार या समारोह प्रभाव नहीं है.
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Acknowledgments
लेखक pHPL और Margaretha Frühwirth और डेनिएला Thaler उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए प्रदान करने के लिए डॉ. Katharina Schallmoser धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
|
| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
|
| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
|
| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).
Comments
3 Comments
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We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
Diana
Hi Diana,
We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.
Micheline
Hi Micheline
Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.