成人内皮细胞集落形成祖细胞的分离和大型规模扩张

Biology

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Summary

内皮细胞集落形成祖细胞(ECFCs)是一种很有前途的的工具来研究血管稳态和维修。

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Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).

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Abstract

本文介绍了一个新颖的恢复策略,对内皮细胞集落形成祖细胞肝素(ECFCs),但在其他unmanipulated成人外周血内,平均12天。 > 1 × 10 8 ECFCs大规模扩张后可以得到进一步的测试。有利的是,通过使用pHPL人体细胞与牛血清抗原的接触可以被排除在外。通过流式细胞仪和免疫组化分离的细胞可以被定性为ECFC 和他们在体外的功能,形成像血管结构,可在基质胶实验测试。这些细胞可皮下注射的小鼠模型,以形成功能, 体内血管灌注。经过长期的扩张和冷冻保存扩散,功能和基因组的稳定性出现3,4予以保留。

这种动物蛋白的隔离和扩展方法是很容易适用于生成大量的ECFCs。

Protocol

A)ECFC ISOLATON

第一天:

  1. 之前,请先准备实验的细胞培养液中血管内皮生长培养基- 2(EGM - 2)。补充500毫升内皮细胞基础培养基与肝素(000 U / ml的1毫升)2,青霉素/链霉素100X 5ml的解决方案(所有Sigma公司,圣路易斯,密苏里州; www.sigmaaldrich.com ),L -谷氨酰胺(终浓度为2毫米),并汇集人类血小板裂解液(pHPL)50毫升。然后添加2毫升hFGF - B的,氢化可的松0.2毫升,0.5毫升血管内皮生长因子,0.5毫升表皮生长因子,IGF - 1和0.5毫升的抗坏血酸(如SingleQuots提供0.5毫升,所有龙沙,Walkersville,MD ; http://www.lonzabioscienceCOM / )。无菌滤液通过一个0.2米孔径大小500毫升Millipore公司真空过滤介质。由于pHPL形成小血块,您可能需要一个中型的两个过滤器。预温过滤临时股东大会,2至37 ° C水浴中
  2. 收集到一个6毫升不含防腐剂钠肝素血液真空采血管管从肘静脉成人外周血5毫升的血液样本。最大的两个小时内,你应该处理的血液样本。
  3. 开始准备一个75厘米的2(T75;中光学)一个通风帽,一个25毫升吸管和两个5毫升移液器在层流台的容量瓶中。
  4. 预填充15毫升预热补充到烧瓶中,用25毫升吸管EGM - 2。现在打开血小瓶样品所有5毫升5毫升吸管入烧瓶。空血小瓶5毫升额外EGM - 2的第二个5毫升吸管冲洗。 T75内的总体积为25毫升。关闭通风帽的容量瓶中,并在孵化器的地方,在37℃,5%CO 2和95%湿度为24小时。

第2天:

  1. 经过约24小时(过夜),你应该删除中期血的混合物,除去非贴壁细胞。对于这个准备两个25毫升移液管和层流三个5毫升移液器,预温20毫升至37 ° C水浴中补充EGM - 2)和(前一天准备30毫升PBS。
  2. 从培养箱取出样品的容量瓶中,并删除所有与25毫升吸管的上清液。小心不要划伤烧瓶的表面,避免损坏任何潜在的殖民地。内瓶细胞黏附表面洗净,轻轻地从一个侧面添加10毫升预热PBS和倾斜烧瓶其他三次。取出PBS立即每次和丢弃。
  3. 添加20毫升的新鲜预热EGM - 2的烧瓶中,放入孵化器。这个过程应该是尽可能快,尽可能温柔的贴壁细胞不分离。 ECFCs分离容易,如果他们是在PBS或在室温下保持长期。
  4. 通过烧瓶屏幕系统每隔一天一天两起使用低倍率轻显微镜寻找ECFC产物。当一个殖民地被发现在上面标记的指示殖民地的地位瓶的外侧。注意的flaks不应超过5分钟外的孵化器。

第5天:

  1. 在播种后第五天执行一个完整的介质变化,除去非贴壁细胞。为此预温20毫升EGM - 2至37 ° C水浴中,并准备两个25毫升移液器。
  2. 用25毫升吸管取出完全培养基,并添加新鲜,预热补充EGM - 2尽快。细胞不应该没有超过一分钟,以避免干燥介质。进入孵化器的地方回来,每天重复筛查烧瓶。
  3. 饲料中的细胞更换新鲜补充EGM - 2每周两次30%的中等。

日14-28:

  1. 鹅卵石形态的典型菌落出现12天左右。马克烧瓶上方的外侧,表明每个殖民地的位置。允许的殖民地,直到第28天增长,除非单细胞开始分离。有一次,小学殖民地已经确定,他们可以收获14和28天之间,这取决于它们的大小。

B.)ECFC收获

  1. 预温5毫升胰蛋白酶0.05%/ EDTA,20毫升PBS和5毫升新鲜补充EGM - 2。
  2. 彻底清除介质从烧瓶成猎鹰管(小心不要触摸表面的容量瓶中,以避免损坏任何潜在的殖民地),仔细用10 ml预热的PBS洗细胞。
  3. 在孵化器5分钟,加入5毫升胰蛋白酶/ EDTA和孵化。细胞不应超过7分钟的暴露,就变成有毒的胰蛋白酶,因为。彻底攻烧瓶双方,有利于细胞分离。淬火加入约10毫升的保留使用的培养基的胰蛋白酶蛋白酶活性。
  4. 删除到50毫升法尔科的细胞悬液n管。洗烧瓶曾经用10 ml PBS,这是以后添加到收获的细胞悬液。离心细胞悬液300克7日在4分钟° C至收集细胞并去除胰蛋白酶。弃上清,并立即在1毫升PBS重悬细胞沉淀。置于冰上。
  5. 确定细胞数量在朱庇特的协议,由R.李嘉图和K. Phelani 5。

C)ECFC扩展

  1. 补充500毫升EGM - 2在1.1中所述)。预温至37℃,水浴。
  2. 对于约2500平方厘米的文化空间,准备一个为11 T220(225 厘米2)或15 T175(175 厘米 2)或一个四层次的细胞工厂(CF - 4; NUNC,Naperville的,IL ; http://www.nuncbrand COM )。此外,您将需要两个新鲜通风帽和一个特殊的无菌层流台漏斗。
  3. 要在起始细胞密度为100种子ECFCs C /厘米2的细胞数的计算是必要的。对于一个CF - 4 252800细胞悬浮在500毫升的新鲜EGM - 2,浇成的CF - 4使用无菌漏斗。关闭排气第一个发泄的CF - 4一个经度一侧倾斜,使媒介之间的所有4个面粉的平等分配。然后倾斜室和开放式排气帽盖。放置在孵化器CF - 4。
  4. 变化中至少每周一次,直到CF - 4的20%是融合。
  5. 收获细胞中所述B)使用70毫升的胰蛋白酶/ EDTA,约200毫升PBS。

代表性的成果

使用这种隔离方法,我们观察到在12天的主要的集落形成。在先前的研究能够收回平均为4.0 ± 0.8每毫升外周血所得的ECFC 殖民地 4 ECFCs显示一个典型的鹅卵石外观。大规模扩张后,用了100个细胞/平方厘米的播种密度中,我们获得了一个由3男1女志愿者(年龄26至50岁之间)约30天的总> 1 × 10 8个细胞。

在这些条件下培养ECFC增生,功能和基因组稳定4此外细胞可以储存在进一步利用液氮(10%DMSO)3,4

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Discussion

这种新颖的隔离和扩展方法是一种简单而有效的过程,更有效率和更短的时间消耗,避免任何细胞分离(不需要密度梯度),比传统技术更便宜。通过使用pHPL接触到牛抗原和公认的后续xenoimmunization被排除在外。文化期间可形成小血块,pHPL造成。根据我们的经验,这些凝块不影响细胞集落形成和细胞增殖或功能。

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Acknowledgments

作者感谢提供优秀的技术协助pHPL和Margaretha Frühwirth和丹妮拉泰勒博士卡塔琳娜Schallmoser。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endothelial basal Medium-2 Lonza Inc. 500ml
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin Biochrom AG 10U/ml per EGM-2
L-Glutamine Sigma-Aldrich 2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin Sigma-Aldrich 100U/mL Penicillin and
100μg/mL Streptomycin per
EGM-2
Trypsin/1mM EDTA Invitrogen 7ml for T75 flask
70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4) Corning
Sterile Funnel Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap) Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) BD Biosciences preloaded with 108 IU/6ml of
preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes Falcon BD
5ml Stripetts Costar
25ml Stripetts Costar
Squeezer Costar
0,2 pore size sterile filter EMD Millipore 2x 500ml per EGM-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
  2. Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  3. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
  4. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
  5. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).

Comments

3 Comments

  1. We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
    Diana

    Reply
    Posted by: Diana P.
    March 26, 2010 - 12:58 PM
  2. Hi Diana,

    We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.

    Micheline

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2010 - 2:27 PM
  3. Hi Micheline
    Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.

    Reply
    Posted by: he f.
    July 19, 2011 - 8:42 AM

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