El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

Biology

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Summary

Endoteliales que forman colonias células progenitoras (ECFCs) son una herramienta prometedora para estudiar la homeostasis vascular y la reparación.

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Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).

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Abstract

Este documento presenta una estrategia de recuperación de la novela de las células endoteliales progenitoras que forman colonias (ECFCs) de heparina pero por lo demás no manipulado adultos sangre periférica humana dentro de una media de 12 días. Después de la expansión a gran escala> 1x10 8 ECFCs se puede obtener por otras pruebas. Ventajosamente con pHPL el contacto de las células humanas con suero bovino antígenos pueden ser excluidos. Por citometría de flujo e inmunohistoquímica las células aisladas pueden ser caracterizados como ECFC y su funcionalidad in vitro para formar las estructuras vasculares, como puede ser probado en un ensayo de matrigel. Además, estas células pueden ser inyectada por vía subcutánea en un modelo de ratón para la formación de vasos funcionales, perfundidos in vivo. Después de la expansión a largo plazo y la proliferación de criopreservación, la función y la estabilidad genómica parece ser preservado 3,4.

Este aislamiento de proteína animal libre y el método de expansión es de fácil aplicación para generar una gran cantidad de ECFCs.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON

DIA 1:

  1. Antes de comenzar con el experimento de preparar el cultivo de células endoteliales de crecimiento medio mediano-2 (EGM-2). Suplemento de 500 ml de medio base endotelial-2 con heparina (1 ml de 1000 U / ml), solución de 5 ml 100x de penicilina / estreptomicina (todos Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (2 mM concentración final de ), y 50 ml de lisado de plaquetas humanas agrupados (pHPL). A continuación, añadir 0,2 ml de hidrocortisona, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml de VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml de IGF-1 y 0,5 ml de ácido ascórbico (siempre como SingleQuots, todos Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience. com / ). Filtrado estéril el medio a través de 0,2 m de tamaño de poro 500 ml filtro de vacío Millipore. Desde pHPL forma coágulos pequeños es posible que tenga dos filtros de un medio. Pre-caliente filtrada EGM-2 a 37 ° C en un baño de agua
  2. Recoger las muestras de sangre mediante la elaboración de 5 ml de sangre periférica humana adulta de la vena cubital en un conservante 6ml libre de sodio heparina tubo vacutainer de sangre. Se debe procesar las muestras de sangre en un plazo máximo de dos horas.
  3. Comience por la preparación de una 75 cm 2 (T75, Costar) frasco con una tapa ranurada, una pipeta de 25 ml y dos pipetas de 5 ml en un banco de flujo laminar.
  4. Pre-llenado 15 ml previamente calentada complementado EGM-2 en el matraz con la pipeta de 25 ml. Ahora abra el vial muestra de sangre y todos los de 5 ml con la pipeta de 5 ml en el matraz. Enjuague el frasco vacío de sangre con 5 ml de adicionales EGM-2 con el segundo 5 ml pipeta. El volumen total dentro de la T75 es de 25 ml. Cierre la tapa del respiradero de la botella y coloque en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 y el 95% de humedad durante 24 horas.

DIA 2:

  1. Después de aproximadamente 24 horas (durante la noche) debe retirar la mezcla de sangre medio para deshacerse de las células no adherentes. Para esta preparación de dos pipetas de 25 ml y tres pipetas de 5 ml en el flujo laminar, pre-caliente 20 ml de complementarse EGM-2 (preparado el día anterior) y 30 ml de PBS a 37 ° C en un baño de agua.
  2. Retirar el matraz con la muestra de la incubadora y eliminar todas las sobrenadante con una pipeta de 25 ml. Tenga cuidado de no rayar la superficie del frasco para evitar daños en cualquiera de sus colonias potencial. Lave la superficie interna de la célula frasco de adhesión tres veces suavemente añadiendo 10 ml de pre-calentado PBS y la inclinación de la botella de un lado a otro. Retire la PBS inmediatamente cada vez y desechar.
  3. Añadir 20 ml de agua dulce precalentado EGM-2 en el matraz y colocarlo de nuevo en la incubadora. Este proceso debe realizarse lo más rápido y suave como sea posible para que las células adjunto no se puede desprender. ECFCs desprenderse fácilmente si se mantienen en PBS a temperatura ambiente o para la de largo plazo.
  4. Pantalla a través del matraz sistemáticamente cada dos días a partir de dos días con un bajo aumento de un microscopio de luz en busca de fruto ECFC. Cuando una colonia se encuentra la marca en la parte superior de la parte externa de la botella que indica la posición de la colonia. Tenga en cuenta que el matraz no debe estar fuera de la incubadora por más de 5 minutos.

DIA 5:

  1. En el quinto día después de la siembra realizar un cambio de medio completo para eliminar las células no adherentes. Para ello pre-calentar 20 ml de EGM-2 a 37 ° C en un baño de agua y preparar dos pipetas de 25 ml.
  2. Retire el medio completo con una pipeta de 25 ml y añadir nuevos, pre-calentado EGM-2 complementado tan pronto como sea posible. Las células no se debe dejar sin medio de más de un minuto para evitar que se seque. Coloque de nuevo en la incubadora y repetir detección del frasco al día.
  3. Alimentar a las células mediante la sustitución de 30% de medio fresco suplementado por EGM-2 veces por semana.

DÍA 14-28:

  1. Las colonias típicas con la morfología de adoquines debe aparecer alrededor del día 12. Marque la parte superior externa de la botella para indicar la posición de cada colonia. Permitir a las colonias a crecer hasta el día 28 a menos que las células individuales comienzan a desprenderse. Una vez, las colonias de primaria han sido identificados que pueden ser cosechadas entre los días 14 y 28, dependiendo de su tamaño.

B.) ECFC COSECHA

  1. Pre-caliente 5 ml de tripsina 0,05% / EDTA, 20 ml y 5 ml de PBS fresco suplementado EGM-2.
  2. Eliminar por completo medio de la mufla en un tubo Falcon (tenga cuidado de no tocar la superficie de la botella para evitar daños en cualquiera de sus colonias potenciales) y lavar cuidadosamente con células ml de PBS 10 precalentado.
  3. Añadir 5 ml de tripsina / EDTA y se incuba durante 5 minutos en la incubadora. Las células no deben ser expuestos a la tripsina por más de 7 minutos, ya que se vuelve tóxico. Bien tocando los lados del frasco de ayuda a las células para separar. Apagar la actividad de la proteasa tripsina mediante la adición de aproximadamente 10 ml del medio de cultivo utilizado conservado.
  4. Levantar la suspensión celular en un Falco 50 mln del tubo. Lavar el matraz una vez con 10 ml de PBS, que es a partir de entonces a la suspensión de células cosechadas. Se centrifuga la suspensión celular a 300 g durante 7 min a 4 ° C para recoger las células y eliminar la tripsina. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular de inmediato en 1 ml de PBS. Mantener en hielo.
  5. Determinar el número de células como se describe en un protocolo JoVe por Ricardo R. y K. Phelani 5.

C) ECFC EXPANSIÓN

  1. Suplemento de 500 ml EGM-2 como se describe en un 1,1). Pre-caliente a 37 ° C en un baño de agua.
  2. Por espacio de aproximadamente 2.500 cm 2 preparar una cultura o 11 T220 (225 cm 2) o 15 T175 (175 cm 2) o una de cuatro capas de células de fábrica (CF-4, Nunc, Naperville, IL; http://www.nuncbrand . com ). Además se necesitan dos frescos de ventilación, las tapas y un embudo estéril especial, en el banco de flujo laminar.
  3. Para ECFCs semilla a una densidad celular inicial de 100 c / cm 2 el cálculo del número de células es necesario. Por un CF-4 252 800 células se resuspenden en 500 ml fresca EGM-2 y se vierte en el CF-4 utilizando el embudo estéril. Cerca de un respiradero de ventilación con la capitalización y la inclinación de la CF-4 a un lado de longitud, lo que permite una distribución equitativa del medio entre los 4 harinas. A continuación, la inclinación de la cámara posterior y abra la tapa del respiradero-cap. Lugar CF-4 en la incubadora.
  4. 20% de cambio del medio de por lo menos una vez por semana hasta el CF-4 es confluente.
  5. Las células de la cosecha como se describe en B) mediante el uso de 70 ml de tripsina / EDTA y aproximadamente 200 ml de PBS.

Los resultados representativos

El uso de este método de aislamiento se observó una formación de colonias de primaria en el día 12. En un estudio anterior fueron capaces de recuperar una media de 4,0 ± 0,8 ECFC-colonias derivadas de cada ml de sangre periférica. ECFCs 4 mostró un aspecto típico de adoquines. Después de la expansión a gran escala, con una densidad de siembra de 100 células / cm 2, se obtuvo> 1 x 10 8 células en un total de aproximadamente 30 días a partir de 3 hombres y 1 mujeres voluntarias (edad entre 26 y 50 años).

ECFC cultivadas en estas condiciones, se demostró que proliferativa, funcional y estable genómicamente. 4 Además las células pueden ser almacenadas (en el 10% DMSO) en nitrógeno líquido para su uso posterior 3,4.

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Discussion

Este aislamiento novela y el método de expansión es un proceso sencillo y eficiente que es más eficiente y menos tiempo, evitando la separación de células (no hay gradiente de densidad es necesario) y menos costoso que las técnicas convencionales. Mediante el uso de contacto pHPL a los antígenos de la especie bovina y xenoimmunization siguientes supuestos se excluye. Durante el período de cultivo pequeños coágulos se pueden formar, causada por la pHPL. Basándonos en nuestra experiencia estos coágulos no afectan a la formación de colonias y la proliferación celular o la función.

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Acknowledgments

Los autores agradecen a la Dra. Katharina Schallmoser para proporcionar pHPL y Frühwirth Margaretha y Thaler Daniela por su excelente asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endothelial basal Medium-2 Lonza Inc. 500ml
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin Biochrom AG 10U/ml per EGM-2
L-Glutamine Sigma-Aldrich 2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin Sigma-Aldrich 100U/mL Penicillin and
100μg/mL Streptomycin per
EGM-2
Trypsin/1mM EDTA Invitrogen 7ml for T75 flask
70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4) Corning
Sterile Funnel Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap) Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) BD Biosciences preloaded with 108 IU/6ml of
preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes Falcon BD
5ml Stripetts Costar
25ml Stripetts Costar
Squeezer Costar
0,2 pore size sterile filter EMD Millipore 2x 500ml per EGM-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
  2. Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  3. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
  4. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
  5. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).

Comments

3 Comments

  1. We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
    Diana

    Reply
    Posted by: Diana P.
    March 26, 2010 - 12:58 PM
  2. Hi Diana,

    We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.

    Micheline

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2010 - 2:27 PM
  3. Hi Micheline
    Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.

    Reply
    Posted by: he f.
    July 19, 2011 - 8:42 AM

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