Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

Biology

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Summary

Cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) sono uno strumento promettente per studiare l'omeostasi vascolare e la riparazione.

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Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).

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Abstract

Questo lavoro introduce una nuova strategia di recupero per le cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) da eparinato ma per il resto non manipolata adulto periferici umani all'interno di una media di 12 giorni. Dopo l'espansione su larga scala> 1x10 8 ECFCs può essere ottenuto per ulteriori test. Vantaggiosamente utilizzando pHPL il contatto delle cellule umane con antigeni siero bovino può essere escluso. Mediante citometria di flusso ed immunoistochimica delle cellule isolate può essere caratterizzato come ECFC e la loro funzionalità in vitro per formare strutture di tipo vascolare possono essere testati in un test di Matrigel. Inoltre queste cellule possono essere iniettati per via sottocutanea in un modello murino di forma funzionale, vasi perfusi in vivo. Dopo un lungo periodo di espansione e la proliferazione crioconservazione, la funzione e la stabilità genomica sembrano essere conservati. 3,4

Questo animale-proteina isolamento libero e il metodo di espansione è facilmente applicabile a generare una grande quantità di ECFCs.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON

GIORNO 1:

  1. Prima di iniziare con l'esperimento preparare la cultura della crescita delle cellule endoteliali medio a medio-2 (EGM-2). Supplemento 500ml endoteliale basale medio-2 con eparina (1 ml di 1000 U / ml), 5 ml soluzione 100x di penicillina / streptomicina (tutti Sigma, St. Louis, MO, www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (concentrazione 2 mM finale ), e 50 ml pool lisato piastrinico umano (pHPL). Quindi aggiungere 0,2 ml di idrocortisone, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml di VEGF, EGF 0,5 ml, 0,5 ml di IGF-1 e 0,5 ml di acido ascorbico (fornito come SingleQuots, tutti Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience. com / ). Sterile filtrato del mezzo attraverso un m-pori 0,2 dimensioni 500 ml vuoto filtro Millipore. Dal pHPL forme coaguli piccoli potrebbe essere necessario due filtri per un mezzo. Preriscaldare filtrata EGM-2 a 37 ° C in un bagno d'acqua
  2. Raccogliere i campioni di sangue da disegno 5 ml di sangue periferico umano adulto dalla vena cubitale in una 6ml senza conservanti sodio-eparina tubo sangue vacutainer. Si dovrebbe trattare i campioni di sangue entro un massimo di due ore.
  3. Iniziate preparando una compressa da 75 cm 2 (T75; Costar) recipiente con un tappo di sfiato, pipetta da 25 ml e due 5 pipette ml in un banco a flusso laminare.
  4. Pre-compilati 15 ml preriscaldata integrato EGM-2 nel pallone con la pipetta da 25 ml. Ora aprite la fiala di sangue e campioni tutti e 5 ml con la pipetta 5 ml nel pallone. Sciacquare la fiala vuota di sangue con 5 ml di ulteriori EGM-2 con la seconda pipetta da 5 ml. Il volume totale entro il T75 è di 25 ml. Chiudere il ventilato-cap del pallone e mettere in termostato a 37 ° C, 5% CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore.

2 ° GIORNO:

  1. Dopo circa 24 ore (durante la notte) è necessario rimuovere il medio impasto sangue per liberarsi di cellule non aderenti. Per questo preparare due pipette 25 ml e tre 5 pipette ml nel flusso laminare, pre-riscaldare 20 ml di integrare EGM-2 (preparato il giorno precedente) e 30 ml di PBS a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Rimuovere il pallone con il campione dal termostato e rimuovere tutti i surnatante con una pipetta 25 ml. Fare attenzione a non graffiare la superficie pallone evitare di danneggiare qualsiasi potenziale colonia. Lavare la superficie interna delle cellule fiasco aderenza tre volte con delicatezza l'aggiunta di 10 ml di pre-riscaldato PBS e inclinando il pallone da un lato all'altro. Rimuovere la PBS immediatamente ogni volta e scartare.
  3. Aggiungere 20 ml di fresca pre-riscaldato EGM-2 al pallone e rimetterlo a dell'incubatore. Questo processo deve essere eseguita il più veloce e gentile possibile, per le cellule collegate non a staccarsi. ECFCs staccare facilmente se sono tenuti in PBS o a temperatura ambiente per lungo.
  4. Schermo attraverso il pallone sistematicamente ogni due giorni a partire da due giorni con un basso ingrandimento di un microscopio ottico in cerca di escrescenza ECFC. Quando una colonia si trova segno sulla parte superiore sul lato esterno del pallone che indica la posizione della colonia. Si noti che il flaks non dovrebbe essere al di fuori dell'incubatore per più di 5 minuti.

GIORNO 5:

  1. Il quinto giorno dopo la semina effettuare un cambiamento completo di media per rimuovere le cellule non aderenti. A tal fine pre-riscaldare 20 ml di EGM-2 a 37 ° C in un bagno d'acqua e preparare due pipette 25 ml.
  2. Rimuovere il terreno completo con una pipetta 25 ml e aggiungere fresco, pre-riscaldata EGM-2 completate, non appena possibile. Le cellule non devono essere lasciati senza prodotto per più di un minuto per evitare l'essiccamento. Mettere nuovamente dentro l'incubatrice e ripetere lo screening del pallone tutti i giorni.
  3. Nutrire le cellule, sostituendo il 30% dei media da parte fresca integrato EGM-2 volte alla settimana.

GIORNO 14-28:

  1. Le colonie tipiche con morfologia ciottoli dovrebbe apparire intorno al giorno 12. Segna la parte superiore esterna del pallone ad indicare la posizione di ogni colonia. Lasciare le colonie a crescere fino a 28 giorni a meno che le singole cellule iniziano a staccarsi. Una volta, le colonie principali sono stati identificati possono essere raccolto tra i giorni 14 e 28, a seconda delle loro dimensioni.

B.) ECFC VENDEMMIA

  1. Preriscaldare 5 ml 0,05% tripsina / EDTA, 20 ml di PBS e 5ml fresca integrato EGM-2.
  2. Rimuovere completamente medio dal pallone in un tubo Falcon (fare attenzione a non toccare la superficie del pallone per evitare di danneggiare qualsiasi colonia potenziali) e lavare accuratamente le cellule con 10 ml di PBS preriscaldata.
  3. Aggiungere 5 ml di tripsina / EDTA e incubare per 5 minuti in incubatrice. Le cellule non devono essere esposti a tripsina per più di 7 minuti dal momento che diventa tossica. Accuratamente toccando i lati del pallone aiuta le cellule a staccarsi. Spegnere l'attività della proteasi tripsina con l'aggiunta di circa 10 ml del mezzo utilizzato conservato cultura.
  4. Rimuovere sospensione cellulare in un 50 ml Falcon tubo. Sciacquare il pallone una volta con 10 ml di PBS, che è successivamente aggiunto alla sospensione cellulare raccolto. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 g per 7 minuti a 4 ° C per raccogliere le cellule e rimuovere la tripsina. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare immediatamente in 1 ml di PBS. Tenere su ghiaccio.
  5. Determinare il numero di cellule, come descritto in un protocollo di JOVE di R. Ricardo e K. Phelani 5.

C.) ECFC ESPANSIONE

  1. Supplemento 500 ml EGM-2, come descritto in A 1.1). Pre-riscaldamento a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Per circa 2500 cm 2 di spazio cultura preparare una o 11 T220 (225 cm 2) o 15 T175 (175 cm 2) o uno a quattro strati fabbrica di cellule (CF-4; Nunc, Naperville, Illinois; http://www.nuncbrand . com ). Inoltre avrete bisogno di due nuove sfiato-cap e un imbuto speciale sterile in panchina flusso laminare.
  3. Per ECFCs seme con una densità di cellule di partenza di 100 c / cm 2 calcolo del numero delle cellule è necessaria. Per una CF-4 252.800 cellule sono risospese in 500 ml di fresca EGM-2 e versato nella CF-4 con l'imbuto sterile. Chiudere uno sfogo con lo sfiato-cap e inclinare il CF-4 da un lato longitudine, consentendo una distribuzione uniforme del mezzo tra tutte e 4 le farine. Poi inclinare la camera posteriore e aprire il coperchio del sfiato-cap. Luogo CF-4 in incubatrice.
  4. Cambia il 20% della media almeno una volta alla settimana fino CF-4 è confluenti.
  5. Celle di raccolta, come descritto in B.) utilizzando 70 ml di tripsina / EDTA e circa 200 ml di PBS.

RAPPRESENTANTE RISULTATI

Usando questo metodo isolamento abbiamo osservato una formazione primaria colonia al giorno 12. In uno studio precedente erano in grado di recuperare una media di 4,0 ± 0,8 ECFC-colonie derivate da ogni ml di sangue periferico. ECFCs 4 ha mostrato un aspetto tipico di ciottoli. Dopo l'espansione su larga scala, con una densità di semina di 100 cellule / cm 2, abbiamo ottenuto> 1 x 10 8 cellule in un totale di circa 30 giorni da 3 maschi e 1 volontari di sesso femminile (età compresa tra i 26 e 50 anni).

ECFC colto in queste condizioni hanno dimostrato di essere proliferativa, funzionale e stabile genomicamente. 4 Inoltre cellule possono essere conservate (nel 10% DMSO) in azoto liquido per un ulteriore uso. 3,4

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Discussion

Questo isolamento romanzo e il metodo di espansione è un processo semplice ed efficiente che è più efficiente e meno che richiede tempo, evitando qualsiasi separazione cellulare (gradiente di densità non necessario) e meno costoso rispetto alle tecniche convenzionali. Usando contatto pHPL agli antigeni della specie bovina e putativo xenoimmunization successivo è esclusa. Durante il periodo di cultura piccoli coaguli si possono formare, causata dal pHPL. Sulla base della nostra esperienza di questi coaguli di non effetto la formazione di colonie e la proliferazione cellulare o funzione.

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Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dott. Katharina Schallmoser per la fornitura di pHPL e Margaretha Frühwirth e Daniela Thaler per un'eccellente assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endothelial basal Medium-2 Lonza Inc. 500ml
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin Biochrom AG 10U/ml per EGM-2
L-Glutamine Sigma-Aldrich 2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin Sigma-Aldrich 100U/mL Penicillin and
100μg/mL Streptomycin per
EGM-2
Trypsin/1mM EDTA Invitrogen 7ml for T75 flask
70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4) Corning
Sterile Funnel Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap) Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) BD Biosciences preloaded with 108 IU/6ml of
preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes Falcon BD
5ml Stripetts Costar
25ml Stripetts Costar
Squeezer Costar
0,2 pore size sterile filter EMD Millipore 2x 500ml per EGM-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
  2. Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  3. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
  4. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
  5. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).

Comments

3 Comments

  1. We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
    Diana

    Reply
    Posted by: Diana P.
    March 26, 2010 - 12:58 PM
  2. Hi Diana,

    We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.

    Micheline

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2010 - 2:27 PM
  3. Hi Micheline
    Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.

    Reply
    Posted by: he f.
    July 19, 2011 - 8:42 AM

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