Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

Biology

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Summary

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

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Lee, S., Hallam, S. J. Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments. J. Vis. Exp. (33), e1569, doi:10.3791/1569 (2009).

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Abstract

O microbioma do solo é um reservatório vasto e relativamente inexplorado da diversidade genômica e inovação metabólica que está intimamente associado com nutrientes e fluxo de energia nos ecossistemas terrestres. Cultivo independente de genômica ambiental, também conhecida como metagenomic, abordagens prometem um acesso sem precedentes a essa informação genética no que diz respeito à reconstrução caminho e triagem funcional para terapêuticas de alto valor e os processos de conversão de biomassa. No entanto, o microbioma solo ainda permanece um desafio em grande parte devido à dificuldade na obtenção de DNA de alto peso molecular de qualidade suficiente para a produção de grandes inserir biblioteca. Aqui nós apresentamos um protocolo para a extração de alto peso molecular, o DNA genômico microbiana comunidade de solos e sedimentos. A qualidade do DNA genômico isolado é ideal para a construção de grandes bibliotecas genômicas inserir ambientais para aplicações a jusante seqüenciamento e análise.

O procedimento começa com a lise celular. Paredes celulares e membranas de micróbios são lisadas por ambas as forças mecânicas (trituração) e químicas (β-mercaptoetanol). DNA genômico é então isolado usando tampão de extração, clorofórmio-álcool isoamílico e álcool isopropílico. Os buffers empregados para a lise e os passos de extração incluem isotiocianato de guanidina e brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) para preservar a integridade do DNA genômico de alto peso molecular. Dependendo da sua aplicação a jusante, o DNA genômico isolado pode ser purificado usando cloreto de césio (CsCl) ultracentrifugação de gradiente, o que reduz as impurezas, incluindo os ácidos húmicos. O primeiro procedimento, a extração, leva aproximadamente 8 horas, com exclusão de etapa de quantificação de DNA. A ultracentrifugação gradiente de CsCl, é um processo de dois dias. Durante todo o procedimento, o DNA genômico deve ser tratada com cuidado para evitar corte, evitar vórtex grave e dura pipetagem repetitiva.

Protocol

Parte I: Extração de DNA

Procedimento

1. 8 horas são necessárias, para o processamento de 6 amostras excluindo quantificação de DNA.

Antes de iniciar a extração, você vai precisar de pré-chill morteiro pilão, e espátula em um freezer -20 ° C ou usando nitrogênio líquido. Além disso, pré-chill tubos de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio álcool isoamílico (24:1) no gelo. Definir o forno de hibridação a 65 ° C para pré-aquecer. Verifique solução CTAB, se é cristalizado quente a 60 ° C para derreter os cristais. Completar a solução de desnaturação e tampão de extração, adicionando os ingredientes passada, pouco antes de começar a extração (veja a receita abaixo). Realizar todos os procedimentos de extração em uma capela.

2. Preparar o tampão de desnaturação e tampão de extração.
Nota: Para maximizar o rendimento de DNA, é fundamental para fazer precisamente buffers seguir as instruções.

3. Colocar 2 g de solo em uma argamassa pré-refrigeradas.
Nota: O solo coletados em campo devem ser congeladas em gelo seco para o transporte e armazenadas a -80 ° C. Descongelar e solo peneira com uma peneira de 2 mm antes da extração do DNA. Você pode aumentar o montante inicial do solo até 10 g.

4. Adicionar 1 ml de solução de desnaturação ao solo.

5. Congelamento e moer o solo em N 2 líquido usando um pilão até que as partículas do solo olhar em pó e homogênea. Repita congelamento e trituração duas vezes.
Nota: Mantenha a amostra de solo congelado durante a moagem, utilizando nitrogênio líquido suficiente para cobrir totalmente a amostra de solo. Derretendo ligeira durante a moagem é aceitável.

6. Transferir o solo de terra para um tubo de 50 ml com uma espátula de pré-refrigerados.
Nota: A amostra de solo solo podem ser armazenadas a -80 ° C neste momento, se necessário.

7. Adicionar 9 ml de tampão de extração. Para misturar a solução e no solo, brevemente vortex em baixa velocidade.
Nota: Para garantir o buffer é homogênea, aquecê-lo a 60 ° C por 10-15 minutos antes de usar. Manter o resto de tampão a 60 ° C em toda a extração. Vortex em velocidade 8 (numa escala onde 10 é o máximo).

8. Incubar por 40 min a 65 ° C em um forno de hibridização. Durante a incubação, os tubos de girar continuamente na velocidade mais baixa, ou inverter cuidadosamente os tubos a cada 10 minutos.
Nota: Coloque o tubo horizontalmente em um forno de hibridização para permitir buffer de entrar em contato com o solo sobre uma grande superfície. A solução pode parecer um pouco viscoso durante a incubação.

9. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para a pré-refrigerados tubo de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), manter no gelo.
Nota: Quando você transferir o sobrenadante, tome cuidado para não perturbar a camada orgânica (camada inferior). Deixe 1-2 ml de sobrenadante, se for necessário, a fim de coletar somente o sobrenadante limpo. Muitas vezes você pode ver uma camada de bege (mm aproximadamente 1-3 de espessura) em cima do sobrenadante. Não perturbe essa camada ao coletar o sobrenadante. Tente deslizar a ponta ao longo da parede do tubo para impedir a ruptura desta camada bege. Se o sobrenadante é muito turvo, repetir a extração de álcool clorofórmio-isoamílico mais uma vez no sobrenadante. Não use pipetas plásticas descartáveis ​​ao transferir clorofórmio, como clorofórmio irá derreter o plástico. Use uma pipeta de vidro, ou um copo cilindro graduado, ou derramar clorofórmio diretamente em tubos cônicos de 50 ml.

10. Extraia o pelotas do solo mais 2 vezes;

10.1. Adicionar 5 ml tampão de extração para as pelotas do solo, misture delicadamente com 1 ml ponta seguido por vórtex breve em baixa velocidade.
Nota: Agite e misture o buffer antes de usar.

10.2. Incubar a 65 ° C por 10 min em forno de hibridização. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C.
Transfira o sobrenadante para o tubo no passo 9. Manter o tubo com sobrenadante coletado e clorofórmio-álcool isoamílico em gelo durante a extração.
Nota: Certifique-se de adicionar o sobrenadante para o tubo mesmo sem cruzar a mistura entre as amostras.

10.3. Repita 9.1 e 9.2 mais uma vez.

11. Usando uma placa rotativa, muito suavemente balance o tubo que contém o sobrenadante (14-19 ml) e clorofórmio-álcool isoamílico em 1,25 rpm por 10 min.
Nota: Feche a tampa com muito rigor para evitar fugas. Coloque uma toalha de papel sobre a placa de balanço antes de colocar o tubo de modo que qualquer vazamento pode ser facilmente detectado.

12. Centrifugar a 1800 x g, por 20 min a 10-14 ° C.

13. Transferência de fase aquosa para um novo tubo.
Nota: Não perturbar a interfase entre a fase aquosa (camada superior) e camada orgânica (inferiorcamada) quando você transferir o sobrenadante. Deixe aproximadamente 1,5-2 ml sobrenadante para garantir a coleta de apenas sobrenadante limpo.

14. Recuperar o DNA usando álcool isopropílico (15.a etapa - 21.a). Alternativamente, use Amicon ® Ultra-15 Centrífuga Dispositivos Filter (passo 15.b - 21.b) se você esperar muito baixa quantidade de biomassa em sua amostra, que irá produzir pellet dificilmente visível por isopropílico precipitação de álcool que é difícil de recuperar.

15.a. Coloque o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga novo.

16.a. Adicionar álcool isopropílico para o sobrenadante coletado em uma relação de volume de 0.6:1. Inverter os tubos suavemente algumas vezes para misturar.

17.a Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.

18.a. Centrifugar a 16.000 x g, por 20 min a 20-25 ° C. Garantir os pesos de todos os tubos são equilibradas bem antes da etapa de centrifugação.
Nota: Mark a direção da força centrífuga sobre o tubo, para que você possa detectar o pellet de DNA com mais facilidade quando o rendimento de DNA é baixa.

19.a. Remover álcool isopropílico por decantação ou aspiração a vácuo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de DNA.
Nota: Remover álcool isopropílico, logo que a centrifugação seja concluída. Tenha muito cuidado para não perder o pellet de DNA. O tamanho do pellet de DNA pode variar muito, dependendo do tipo de solo, a partir de uma bem visível (~ 9 mm de diâmetro) para apenas visível. É recomendado para remover os resíduos de álcool isopropílico por aspiração ao longo da parede do tubo com cuidado para não sugar o pellet de DNA.

20.a. Seca DNA pellet em temperatura ambiente por 5-20 min.
Nota: Não mais seco pellet de DNA, caso contrário, será difícil para dissolver o DNA.

21.A. Ressuspender o sedimento de DNA em 200 mL de TE. Misturá-lo tocando suave. Transferir a solução de DNA em tubo de 1,5 ml. Manter o tubo a 4 ° C durante a noite, a fim de dissolver completamente DNA.
Nota: Dependendo do tamanho do pellet, você pode ajustar o volume de TE para adicionar. Geralmente 200-400 mL de TE funciona bem.

* Como alternativa, siga os passos 15.b - 21.b.

15.b. Uma pré-lavagem Amicon ® Ultra-15 Centrífuga dispositivos de filtro, adicione 15 ml TE para o dispositivo e centrifugar a 3500 x g, por 10 min. Descartar o escoamento.

16.b. Coloque a solução de DNA a partir do passo 13 para o filtro Amicon pré-lavados. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a 200-500 mL. Descartar o escoamento.

17.b. Lavar o DNA com TE duas vezes; adicionar 10 ml TE aos dispositivos Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a cerca de 200 mL. Descartar o escoamento. Repita mais uma vez.

18-B Transferir a solução de DNA no filtro para um tubo ml novo 1.5.

19.b. Adicionar 40 mL de TE o filtro Amicon. Lavar ambos os lados da membrana do filtro por pipetagem cima e para baixo a fim de recuperar qualquer resíduo de DNA no filtro. Adicionar esta solução de lavagem para o tubo de 18-B passo

20.b. Se necessário, o DNA pode ser ainda mais concentrada por microcontrolador Ultracel YM-30 ® Unidade Centrífuga Filter; pré-lavagem do filtro, adicionando 200 mL de TE e centrifugação a 10.000 x g por 7 minutos. Adicionar a solução de DNA para o filtro e centrifugar a 5000 x g por 1 min. Repetir a centrifugação até que a quantidade de solução de DNA no filtro reduzido a cerca de 50 ul.
Nota: Máximo volume da amostra inicial para microcontrolador filtro é de 500 mL. Não centrifugue a velocidades superiores a 14.000 x g. Não mais de centrífuga até a membrana seca completamente. Garantir que algum líquido ainda cobre o filtro após a centrifugação. Se mais de centrifugado e da membrana está seca, em seguida, adicione 15 mL TE, agitar suavemente durante 30 segundos e avance para o passo 21.b.

21.b. Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um tubo novo microcontrolador e centrifugar a 1000 xg por 3 min para recuperar o DNA.

22. Quantificar DNA por TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V por 4 horas), e por espectrofotômetro Nanodrop ou Pico-verde ensaio e leitor de placas.
Nota: quantidade de DNA pode ser estimado através da comparação da faixa de amostra para a banda marcador com concentração conhecida (marcador molecular de DNA de alta ou λHindIII) sobre o gel.

23. Verificar a integridade do DNA de alto peso molecular por eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) com 1%, 1xTAE gel (Para mais detalhes veja o Passo II, part2 em http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009)..
Nota: Você pode usar gel agarose regulares para essa finalidade QC, em vez de baixa temperatura de fusão agarose. Em resumo, as condições de eletroforese são as seguintes: 02/0250 kb, 6 volts, tempo de comutação inicial: 5 segundos, tempo final de comutação: 15 seg, executado por 12 horas a 14 ° C. Ouro SYBR coloração de uma hora para visualizar o DNA do gel.

24. Se os pesos moleculares de DNA extraídos são satisfatórios, em seguida, avance para a etapa de centrifugação de gradiente de CsCl seguinte. Alternativamente, o DNA pode ser armazenado a -20 ° C ou -80 ° C antes da centrifugação CsCl.
A mediana do tamanho do DNA deve ser igual ou superior a 36 Kb, se você quiser construir uma grande biblioteca de inserir DNA metagenomic.

Parte II. Purificação de DNA usando cloreto de césio ultracentrifugação de gradiente

Preparação de centrifugação: 1,5 - 2 horas
Etapa de centrifugação: 18 horas
Removendo brometo de etídio (EtBr) e concentrando o ADN após a centrifugação: 3 horas

Procedimento

Para detalhes, consulte Wright et al. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352

Resultados representante / Resultado

A quantidade total de DNA genômico isolado de 2 g de floresta orgânica do solo (horizonte O) e horizontes minerais (Ae, AB, Bt e horizontes) (amostragem da produtividade do solo de Longo Prazo (LTSP) site localizado na Skulow lago, BC, Canadá e gerido pela BC Ministério de Florestas e Range) variou de 10 mg a 180 mg. O tamanho médio de DNA isolado foi geralmente entre 40-60 kb (Figura 1). A relação de absorvância a 260 nm foi nm/280 entre 1,3-1,6 e houve um pico em 230 nm, o que pode indicar a contaminação ácidos húmicos freqüentemente observada em amostras de solo. A centrifugação em gradiente de CsCl reduziu drasticamente essa contaminação e também aumentou a proporção de 260/280 para 1,8-1,9, como mostrado na Figura 2a e 2b.

Figura 1
Imagens figura 1. PFGE do DNA genômico extraído antes ultracentrifugação CsCl. lane1: 1 kb marcador 100 ng, pista 2: λHind III marcador 100 ng, pista 3: λHind III marcador 250 ng, pista 4: λHind III marcador 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador 100 ng, pista 6 e 7: genômica DNA isolado do solo de horizonte mineral Ae, pista 8 e 9: o DNA genômico isolado do horizonte AB mineral do solo no local LTSP localizado Skulow lago, BC

Figura 2
Figura 2. Chromograms do DNA genômico detectada pelo espectrofotômetro antes (A) e depois de CsCl ultracentrifugação (B). Observe a redução do valor de absorbância no comprimento de onda nm após 230 CsCl ultracentrifugação, o que indica melhoria na qualidade do DNA genômico. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

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Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Knowledge Development Fund, British Columbia Genoma ea British Columbia Ministério de Florestas e Faixa para apoiar estudos em andamento de produtividade do solo da floresta. SL foi apoiado por uma bolsa da Fundação Centro TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
*Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl
0.5M EDTA, 20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml
5 M NaCl, 300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67, (10), 4495-4503 (2001).
  2. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. (2009).
  3. Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. (2009).

Comments

1 Comment

  1. In you protocol states you use 2 g of soil and 1 mL of denaturing solution. If I want to scale up to 5 or 10 g of soil, do I need to add denaturing solution in the same proportion (2g:1mL)? Better check before start to do anything.

    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Xabier V.
    February 5, 2014 - 6:30 PM

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