التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

Biology
 

Summary

نقدم وسيلة لاسترجاع الحمض النووي المستهدف القديمة تسلسل ، والذي كنا لإعادة بناء كامل الجينوم الميتوكوندريا من خمسة أفراد نندرتل. المقارنة بين هذه المتتاليات مع البشر يومنا هذا قد يوحي بأن Neandertals مدة طويلة انخفاض حجم السكان فعالة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Pääbo, S. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نقدم وسيلة لاسترجاع تسلسل الحمض النووي المستهدف من مصادر الحمض النووي التي تتدهور بشكل كبير وتلوث جرثومي مع الحمض النووي ، كما هي الحال في العظام القديمة. الأسلوب يقلل بدرجة كبيرة من الدمار ومطالب عينة التسلسل النسبي لتوجيه PCR أو نهج التسلسل طلقات نارية. استخدمنا هذا الأسلوب لإعادة بناء كاملة الميتوكوندريا الحمض النووي (و mtDNA) الجينوم خمسة Neandertals من جميع أنحاء نطاقها الجغرافي. كان التنوع الجيني للو mtDNA Neandertals أواخر ثلاث مرات تقريبا أقل من البشر الحديثة المعاصرة. جنبا إلى جنب مع تحليل تطور البروتين و mtDNA ، وهذه البيانات تشير إلى أنه على المدى الطويل حجم السكان الفعلي Neandertals كان أصغر من أن البشر والقردة العليا الحديثة موجودة.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في بريغز وآخرون ، علم 325 (5938). 318-321 (2009) .

الكواشف اللازمة :

  • AmpliTaq البلمرة الذهب الحمض النووي
  • 10X PCR GeneAmp الاحتياطي الثاني
  • 2 MgCl 25mM
  • dNTP المزيج ، 25 مم كل
  • جيش صرب البوسنة ، و 10 ملغ مل - 1 في المياه
  • البيولوجيا الجزيئية في الصف المياه
  • EB العازلة (المتوفرة مع مجموعة MinElute تنقية PCR) و 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.5
  • MinElute أدوات تنقية PCR
  • M - 270 streptavidin Dynabeads
  • 2X وتجليد واغسل (BW) العازلة (2 M كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس - CL ، 1 ملم EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 0.2 ٪ توين 20)
  • 1X وتجليد واغسل (BW) العازلة (2X 2X BindWash العازلة المخفف في الماء)
  • اغسل الساخنة (الأب) العازلة (2.5mM MgCl ، 1X طق الذهب العازلة ، 0.1 ٪ توين 20)

للحصول على معلومات تتعلق بالشركة المصنعة غير القياسية الكواشف والمعدات انظر الجدول في وقت لاحق.

1) مكتبة التضخيم

  1. القالب الحمض النووي هنا هو 454 مكتبة على استعداد من مصدر نسخ الحمض النووي منخفضة كما هو موضح في عدد (رولاند وHofreiter ، 2007a ، 2007b) و (Maricic وPääbo ، 2009). لتضخيم مكتبة بأكملها ، وإعداد المزيج PCR التالية :
    الكاشف في رد فعل ميكرولتر
    ماء 45
    10X جين الأمبير PCR العازلة الثاني 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 ملغ / مل) 2
    dNTPs (25 مم لكل منهما) 1
    454 emPCR FWD primer/10uM 3
    454 primer/10uM emPCR رفس 3
    AmpliTaq بوليميريز الحمض النووي الذهب (5 U / ميكرولتر) 1
    454 قالب الحمض النووي المكتبة 25
    مجموع 100
  2. استخدام البرنامج PCR التالية في cycler الحرارية لتضخيم دورات 14
    1. 95 درجة مئوية 12min
    2. 95 درجة مئوية 30S
    3. 60 درجة مئوية (درجة الحرارة المرغوبة أو الصلب) 1 دقيقة
    4. 72 ° C 1 دقيقة
    5. انتقل إلى 2 (× 13)
    6. 72 ° C 5min
    7. 10 درجة مئوية ∞
  3. تنقية رد فعل أكثر من عمود الدوران Qiagen MinElute وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل في 50 EB العازلة ميكرولتر.
  4. تحديد كمية المنتج تنقية تضخيم فضلا عن قسامة من المكتبة unamplified مع qPCR (ماير وآخرون ، 2007). إذا كان المنتج قد تضخمت أكثر من 1 10 12 X نسخ لكل المجاهدين ، والحد من كمية القالب في خطوة تمهيدية لضمان تمديد التالية التي تمت إضافتها لا يزيد عن 2 X 10 12 نسخة منها إلى رد فعل التمهيدي تمديدها.

2) ملحق التمهيدي

  1. تحضير مزيج الرئيسي للعدد المطلوب من ردود الفعل.
    الكاشف في رد فعل ميكرولتر
    ماء 45
    10X جين الأمبير PCR العازلة الثاني 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 ملغ / مل) 2
    dNTPs (25 مم لكل منهما) 1
    454 emPCR FWD primer/10uM 3
    454 primer/10uM emPCR رفس 3
    AmpliTaq بوليميريز الحمض النووي الذهب (5 U / ميكرولتر) 1
    454 قالب الحمض النووي المكتبة 25
    مجموع 100
  2. تشغيل البرنامج التالي في Thermocycler للتفاعل التمهيدي تمديد واحد :
    1. 95 درجة مئوية 12min
    2. 60 درجة مئوية (أو الصلب الخاص PEC التمهيدي مؤقت إذا كان مختلفا) 1 دقيقة
    3. 72 ° C 5 دقائق
    4. 72 درجة مئوية إلى الأبد!

      خطوة حاسمة احتفظ رد فعل بعد التمديد في 72 درجة مئوية. ثم مباشرة أو ماصة 150ul PBI PB العازلة لتنقية MinElute QIAGEN في الأنابيب قبل إزالة من كتلة الحرارة. هذا مهم لتجنب غير محددة التمهيدي الصلب والاستيلاء على الخليط يبرد.
  3. تنقية رد فعل أكثر من عمود الدوران Qiagen MinElute ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل في 50 EB ميكرولتر.

3) لقطة ملحق المنتج

  1. Resuspend حل سهم M - 270 التي vortexing الخرز. إخراج 25 حبة تعليق ميكرولتر لكل عينة. تغسل حبات مرتين مع BW 500ul العازلة 2X وresuspend العازلة في 25 ميكرولتر 2xBW لكل عينة.
  2. إضافة 25 شطافة ميكرولتر من الخطوة 2.3 إلى 25 حبة تعليق ميكرولتر من الخطوة 3.1. المزيج ثم تدوير : 15 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

    وأوصت : الحفاظ على ما تبقى من المجاهدين 5 شطافة من الخطوة 2.3 لqPCR الكمي.

  3. نقل الخليط كله لأنبوب 1.5ml الطازجة (وهذا يساعد على خفض المرحل من شظايا المكتبة غير المستهدفة). بيليه وطاف به في مجمع الجسيمات المغناطيسية (MPC) وتجاهل طاف.
  4. يغسل 5 مرات مع العازلة 500 1xBW ميكرولتر (يغسل العديد من مساعدة لإزالة الخلفية قدر ممكن). بعد الخطوة غسل الماضي ، وتدور باستمرار لفترة وجيزة ، وإزالة آثار الماضي وطاف.
  5. إضافة 500μl 1X الساخن اغسل (الأب) العازلة. يهز لمدة 2 دقيقة على 65 درجة مئوية (أو 5C فوق تيم التمهيدي PEC) على كتلة الحرارية. إزالة طاف بسرعة بعد ذلك ، للحد من التبريد. (هذه الخطوة لإزالة شظايا الخلفية لا يزال يرتبط مع الاشعال PEC ولكن ليس في الواقع على تمديد خلال خطوة التمديد). إزالة آخر آثار طاف.
  6. Resuspend الكرية حبة العازلة في 30 EB ميكرولتر. نقل الخليط كله لأنبوب 1.5ml الطازجة (وهذا يساعد على خفض المرحل من شظايا المكتبة غير المستهدفة). في احتضان 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في cycler الحراري للشطف. لجنة السياسة النقدية في مكان وإزالة طاف ، مع الحرص على ترك وراء الخرز.

4) لقطة التضخيم المنتج

  1. تحضير مزيج PCR الرئيسي للعدد المطلوب من العينات.
    الكاشف في رد فعل ميكرولتر
    ماء 45
    10X جين الأمبير PCR العازلة الثاني 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 ملغ / مل) 2
    dNTPs (25 مم لكل منهما) 1
    454 emPCR FWD primer/10uM 3
    454 primer/10uM emPCR رفس 3
    AmpliTaq بوليميريز الحمض النووي الذهب (5 U / ميكرولتر) 1
    Eluted التقاط المنتج 25
    مجموع 100
  2. استخدام البرنامج PCR التالية في cycler الحرارية لتضخيم دورات (14) :
    1. 95 درجة مئوية 12min
    2. 95 درجة مئوية 30S
    3. 60 درجة مئوية (درجة الحرارة المرغوبة أو الصلب) 1 دقيقة
    4. 72 ° C 1 دقيقة
    5. انتقل إلى 2 (× 13)
    6. 72 ° C 5min
    7. 10 درجة مئوية ∞
  3. تنقية رد فعل على عمود MinElute Qiagen تدور السيليكا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل العازلة في 50 EB ميكرولتر. يمكن أن تكون المنتجات المستخدمة حاليا إما عن الجولة الثانية من التقاط الصور ، بدءا من الخطوة 2.1 ، أو دخلت مباشرة في البروتوكول 454 PCR مستحلب ، على التسلسل.

ممثل النتائج :

فمن المستحسن عند البدء مع بروتوكول PEC لأداء رد الفعل الأول على التقاط حيث كمية صغيرة من الإيجابية تحكم تسلسل المستهدفين (على سبيل المثال منتج PCR ~ 100bp -- 1 بيكوغرام يكفي بسهولة) وتخلط مع العادي وأوصت تضخيم كمية 454 قالب مكتبة (راجع الخطوة 2.1) ، ويتم تنفيذ التقاط مع التمهيدي PEC واحد تهدف إلى الاستيلاء على مراقبة المنتج إيجابية. يمكن استخدامها إذا تم تنفيذ هذا رد فعل السيطرة ، سواء كانت إيجابية مع qPCR التحكم الخاصة و 454 محول أزواج محددة التمهيدي لقياس كمية من 'هدف السيطرة" في مقابل الخلفية في رد فعل التمهيدي تمديد المنقى (1.3) ، التمهيدي المنتج التمديد (2.3 ) والمنتج eluted التقاط حبة (3.6). في هذه الطريقة ، يمكن كل من فعالية إزالة الخلفية ("خصوصية") وكفاءة الاسترداد المستهدفة ("حساسية") في ظروف تجريبية الخاص تقاس مباشرة.

ناجح PEC بروتوكول ديه عادة الخصائص التالية --

الحساسية (تقاس كمية هدف السيطرة من خلال الإبقاء على البروتوكول) :
المبلغ الإجمالي المستهدف من التحكم في المنتج eluted التقاط حبة (3.6) = ~ 1-20 ٪ من مجموع المبلغ في تنقية التمهيدي رد فعل ملحق (2.3).

الخلفية (التي تقاس 454 emPCR الزوج التمهيدي) :
المبلغ الإجمالي للخلفية في التقاط حبة eluted المنتج (3.6) <0.01 ٪ من مجموع المبلغ في تنقية التمهيدي رد فعل ملحق (2.3).

إذا كان هناك أقل من 1 ٪ من الهدف المتبقية في المنتج النهائي ، قد يكون خطوة التمديد التمهيدي ناجحة ، وينبغي التحقيق فيها.

إذا كان هناك أكثر بكثير من 0.01 ٪ من الخلفية المتبقية في المنتجات النهائية ، قد يكون تم تنفيذ الخطوات غسل غير صحيح ويجب التحقيق فيها.

Discussion

الأسلوب PEC بسيطة وسريعة وحساسة ومحددة. ولذلك فإننا نتصور أن الكتاب تطبيقات متعددة خارج الحمض النووي القديم ، مثل الاستيلاء على أجزاء صغيرة من الحمض النووي الريبي RNA مكتبة والاستجواب من التباين الهيكلي في عينة مجمعة او اعتقال 16S (أو مواضع أخرى) التنوع من عينة metagenomic. نقطة واحدة عن ذكره هو أن حساسية التقاط يصبح أقل حيث أن عدد أجهزة الاشعال PEC في زيادة التفاعل المتعدد الالتقاط. وبالتالي لا PEC مثاليا للقبض على المناطق التقاط كبيرة جدا (مثل megabase أو أكثر) ، ولكن بشكل جيد للغاية يناسب للقبض على المناطق المستهدفة صغيرة أو حتى مواقف العديد من الأفراد من الحزب الوطني الاسكتلندي بطريقة سريعة.

Acknowledgments

نشكر السيد ماير للحصول على المشورة ؛ الأكاديمية الكرواتية للعلوم والفنون ، وأكاديمية برلين براندنبورج للعلوم لتقديم الدعم اللوجستي والعلمي ، وصندوق الابتكار الرئاسي لمعهد ماكس بلانك للحصول على الدعم المالي. كان مدعوما من قبل JMG الزمالة الدولية NSF ما بعد الدكتوراه (OISE - 0754461). وتودع في قاعدة بيانات تسلسل النوكليوتيدات EBI مع أرقام الانضمام : نندرتل 1 (Feldhofer 1) FM865407 ، نندرتل 2 (Feldhofer 2) FM865408 ، Sidron FM865409 1253 ، Vindija 33.25 FM865410 ، Mezmaiskaya 1 FM865411

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 Applied Biosystems N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
M-270 streptavidin beads Invitrogen 653.05
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator Invitrogen 120.02D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325, (5938), 318-321 (2009).
  2. Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42, (3), 343-352 (2007).
  3. Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2, (7), 1756-1762 (2007).
  4. Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46, (1), 51-57 (2009).
  5. Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36, (1), e5-e5 (2007).

Comments

9 Comments

  1. thank you for sharing ! PEC ,it`s still confused in my mind ,can you explain it more commonly ?

    Reply
    Posted by: Qiu Q.
    March 28, 2010 - 10:55 AM
  2. Do you have any recommendation in designing biotinylated primers?
    And, how many independent target biotin-primers could be pooled in a reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 2:08 AM
  3. Primer optimal Tm = 60C (the target-specific part of the primer). Avoid similarity to repetitive DNA elements.

    Up to 150 primers can be used in a single reaction, more are not recommended although it has not been not extensively tested

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 9:47 AM
  4. I read in the sup data from your original paper describing PEC that when designing primers you had also avoided complementarity to adaptors A and B. However it looks pretty much like these sequences are somewhat embargŒd by Roche. Of course, it is still possible to clone the adaptors but I guess you already did so (or managed getting the info from Roche?). Could you provide these seqs? Further, in your experience, are many primers discarded because of that kind of complementarity (guess that Roche designed the adaptors to only fit martian DNA:-)? Finally do you also check autocomplementarity of the spacer+specific primer sequences?
    Many thanks in advance!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 8:28 AM
  5. Hi
    We used the Roche 454-FLX adaptor sequences, which are published (e.g. Margulies et al, Nature ²005). The 454-Titanium adaptor sequences may be embargŒd, I don't know. If you really can't get the sequences you wish to use you can try it without the filtering step in primer design - not many primers get discarded in the process I used (maybe 1% of designs). Illumina sequences are known if you can use that platform.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:23 AM
  6. We haven't ever checked autocomplementarity of the primer and spacer sequence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:25 AM
  7. Were your oligos biotinylated with simple biotin or biotin TEG? What purification method did you choose (DSL, HPLC...)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:53 AM
  8. Many thanks in advance of course!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:57 AM
  9. I used simple biotin and HPLC purification for the oligos.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 10:04 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics