Author Produced

ELIME (انزيم مرتبط المناعي المغناطيسي الكهروكيميائية) طرق الكشف عن السموم الفطرية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويتجلى بروتوكول للكشف عن trichothecenes (السموم الفطرية للقلق على الصحة البشرية) باستخدام أسلوب الفحص وضعت حديثا على أساس أسلوب immunochemical تنافسية وكشف الكهروكيميائية النهائي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Romanazzo, D., Ricci, F., Vesco, S., Piermarini, S., Volpe, G., Moscone, D., Palleschi, G. ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection. J. Vis. Exp. (32), e1588, doi:10.3791/1588 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

المناعية هي بديل صالح للاستهلاك كمية HPLC أكثر كلفة والوقت أو GC 1 ، 2 طرق للكشف فحص السموم الفطرية الخطرة في السلع الغذائية. في هذا البروتوكول نظهر كيفية تلفيق واستجواب انزيم الكهروكيميائية تنافسية مقايسة immunomagnetic مرتبط على أساس استخدام الخرز المغناطيسي ودعما قويا لسلسلة immunochemical 3 و أقطاب الشاشة المطبوعة والاستشعار عن منصة.

لدينا وسيلة تهدف إلى تحديد المبلغ الإجمالي للHT - 2 و T - 2 السموم ، والسموم الفطرية تعود لعائلة trichothecenes وقلق كبير على صحة الإنسان 4. استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ عبر التفاعل مع 100 ٪ من نحو 2 و HT - 2 - T يسمح للكشف عن السموم في وقت واحد على حد سواء مع حساسية مماثلة 5.

الخطوة الأولى للمقايسة لدينا هي الخطوة طلاء أين نحن شل HT2 - KLH السم المتقارن على السطح من الخرز المغناطيسي. بعد خطوة الحجب ، من الضروري تجنب الجواذب غير محددة ، وإضافة ريتوكسيماب يسمح المنافسة بين يجمد HT - 2 و HT - 2 مجانا أو T - 2 موجودة في العينة أو الذائب في محلول قياسي.

في نهاية هذه الخطوة من حيث المنافسة ، وكمية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ترتبط يجمد HT - 2 سوف تكون متناسبة عكسيا مع كمية من السم في حل العينة.

وتستخدم الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) للكشف عن الربط بين الأجسام المضادة المحددة ويجمد HT - 2. يتم تنفيذ الخطوة النهائية قياس ألقت عليه قسامة التعليق حبة المغناطيسي ، والمقابلة لحل محدد / نموذج قياسي ، على سطح القطب الشاشة المطبوعة في العمل ، ويتم يجمد الخرز المغناطيسي ومركزة عن طريق المغناطيس وضعت على وجه التحديد في إطار الشاشة المطبوعة الكهربائي. بعد دقيقتين من الحضانة بين حبات المغناطيسي وركيزة لأب ، يتم الكشف عن المنتج الأنزيمية التي Voltammetry نبض التفاضلية (DPV) باستخدام أداة محمولة (PalmSens) قادرة أيضا على بدء تلقائيا eight قياسات ضمن فاصل زمني من بضع ثوان.

Protocol

1) حظر الخرز المغناطيسي المغلفة :

المضي قدما على النحو التالي لعرقلة الخرز المغناطيسي المغلفة :

  1. إعداد مجموعة من أنابيب إيبندورف 2 مل ؛
  2. التجانس (الهز ولكن ليس vortexing) حبات مغلفة المغناطيسي (انظر الملحق لإعداد حبات المغناطيسي مغلفة) باستخدام عينة الدورية خلاط ؛
  3. مباشرة بعد التجانس ، ماصة 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي في كل الأنابيب المغلفة إيبندورف منفصلة ؛
  4. إضافة 1ml من الحليب منزوع الدسم عرقلة الحل في كل أنبوب إيبندورف من المجموعة ؛
  5. اسمحوا الخرز المغناطيسي احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على خلاط نموذج الدورية ؛
  6. إزالة الحجب الحل : أن تفعل ذلك في مكان الأنبوب المكثف الجسيمات المغناطيسية مع الجزء المغناطيسي وضعت على لمدة 2 دقيقة (انظر الخرز المغناطيسي شائكة على الجدار الجانبي للأنبوب) ؛ ماصة بعناية قبالة طاف ، تاركا حبات دون عائق ؛
  7. إضافة 1 مل من نان PBS عازلة + 3 + جيش صرب البوسنة باعتبارها حلا لتخزين كل أنبوب ؛
  8. تخزين حبات المغناطيسي المغلفة وسدت في 4 درجات مئوية (يرجى ملاحظة أن حبات المغناطيسي المغلفة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أشهر على 4 درجات مئوية) ؛

2) سلسلة مناعية على حبات المغناطيسي لبناء منحنى المعايرة وتحليل العينات

المضي قدما على النحو التالي أن يكون جاهزا الخرز المغناطيسي لقياس :

  1. تأخذ واحدة إيبندورف أنبوب (2 مل) من حل المغلفة وسدت لكل استخراج عينة أنت ذاهب لتحليل ؛
  2. أخذ أنبوب إيبندورف إضافية لكل حل calibrant العمل ؛
  3. التجانس الخرز المغناطيسي لمدة 2 دقيقة على خلاط نموذج الدورية قبل الاستعمال ؛
  4. إزالة السائل التخزين باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف ؛
  5. تغسل حبات المغناطيسي ثلاث مرات بمحلول الغسيل PBS / جيش صرب البوسنة. إزالة غسل السائل ؛
  6. الخطوة المنافسة : أضف لكل أنبوب يحتوي على حبات غسلها المغناطيسي ، واستخراج عينة من 200μl أعدت ، واستخدام أنبوب واحد لكل حبة المغناطيسي العينة. كرر نفس الإجراء لكل حل القياسية. إضافة 200 ميكرولتر من محلول ريتوكسيماب إلى أنبوب كل حبة المغناطيسي. اسمحوا الخرز المغناطيسي احتضان لمدة نصف ساعة على خلاط نموذج الدورية في درجة حرارة الغرفة ؛
  7. إزالة أنابيب من إيبندورف الحل المستخدمة في خطوة المنافسة ؛
  8. وسم الخطوة : أضف 400μl من الأجسام المضادة الثانوية المسمى لكل أنبوب المغناطيسي إيبندورف حبة. اسمحوا الخرز المغناطيسي احتضان لمدة نصف ساعة على خلاط نموذج الدورية في درجة حرارة الغرفة ؛
  9. إزالة العلامات من حل أنابيب إيبندورف ؛
  10. تغسل حبات المغناطيسي ثلاث مرات مع PBS / توين ® 20 حل الغسيل. إزالة السائل ؛
  11. Resuspend 100μl مع كل من إدارة مكافحة المخدرات العازلة قسامة من الخرز المغناطيسي. الآن الخرز المغناطيسي مستعدون للخطوة القياس الكهروكيميائية ؛

3) جمعية PalmSens مع الخيارات (مسك الغزال) المضاعف

يرجى ملاحظة : المنتج من التحلل الأنزيمي الركيزة الأخطاء سطح القطب ، ولهذا السبب هناك حاجة إلى القطب جديد لكل قياس.

  1. توصيل جهاز الكمبيوتر المحمول إلى الكمبيوتر عن طريق كابل PalmSens المسلسل ؛
  2. توصيل القابس من 9 - DIN مع PalmSens CH8 المضاعف.
  3. اتصال كبل تسلسلي الثمانية قناة اتصال مع مسك الغزال الكهربائية CH8 المضاعف ؛
  4. مكان الشريط الكهربائي على كتلة المغناطيس ثمانية. الالتفات الى كل مكان تحت كل أقطاب المغناطيس العمل (لاحظ ، على ضرورة وجود مغناطيس كهربائي واحد لكل أمر حتمي وإلا سوف لا الجسيمات المغناطيسية أن يتركز على منطقة القطب العمل) ؛
  5. سد العجز في قطاع غزة إلى ثمانية أقطاب كهربائية قناة اتصال مسك الغزال ؛

لقياس DPV استخدام المعلمات التالية في المربعات المناسبة :
E تبدأ : 0 (V) ؛ نهاية E : 0.6 (V) ؛ الخطوة الخامسة : 0.016 (V) ؛ E نبض : 0.0339 (V) ؛ E تكييف : معدل المسح الضوئي ؛ : ؛ 0 (V) 0 (V) ترسب E : 0.1 (V / ث) ؛ T نبض : 0.06 (ق) ؛ T تكييف : 0 (ق) ؛ T ترسب : 0 (ق) ؛ T موازنة : 8 (ق).

4) رد الفعل الأنزيمية والقياس الكهروكيميائية

  1. التجانس التي تهز برفق كل أنبوب إيبندورف تحتوي حبات المغناطيسي على استعداد للخطوة القياس الكهروكيميائية من أجل الحصول على تعليق من الخرز كذلك فرقت المغناطيسي ؛
  2. ماصة من كل إيبندورف ، مباشرة بعد التجانس ، وقسامة من 20 ميكرولتر من التشتت حبة المغناطيسي على سطح القطب المقابل العمل. لكل قطب من استخدام شريط واحد 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المأخوذة من أنابيب إيبندورف مختلفة (على سبيل المثال لاستخدام القطب eight eight إيبندورف مختلفة) ؛
  3. إضافة 80 ميكرولتر حل الركيزة الأنزيمية على القطب الأول. بدء العد التنازلي 2 دقيقة. بعد 14 ثانية ، إضافة 80 ميكرولتر من محلول الركيزة الأنزيمية على القطب الثاني. بعد 14 ثانية أخرى ، إضافة 80 ميكرولتر من محلول الركيزة الأنزيمية في القطب الثالث. المضي قدما في الوقت نفسه مادباerval (14 ثانية) حتى القطب الماضي (وهذا يعني : كل قطرة من قسامة الركيزة مع فترات من 14 ثانية). ويتم احتساب الوقت الفاصل الزمني من 14 ثانية والوقت اللازم من قبل potentiostat لأداء القياس ؛ من المذكرة ، فإن الحل 80 ميكرولتر على كل أجهزة الاستشعار ينبغي أن تغطي القطب العمل ، ومرجعية وصفة طبية. وعلاوة على ذلك ، ينبغي للحلول لكل مجس لا تتلامس مع حلول من الأقطاب الكهربائية المجاورة.
  4. بعد 2 دقيقة العد التنازلي من اضافة اولى حل الركيزة الأنزيمية ، بدء القياس الكهروكيميائية ؛
  5. استخدام برامج لايت PalmSens للحصول على قمم الحالية (أمبير) لكل حل.

5) حساب

إنشاء منحنى المعايرة باستخدام معادلة لوجستية 4 معلمات وحساب المبلغ الإجمالي تركيز السم في HT-2/T-2 نانوجرام لكل ملليلتر لكل عينة تحتوي على أنبوب إيبندورف مجهولة.

البيانات التجريبية ، وارتفاع الذروة (أمبير) مقابل تركيز calibrants (نانوغرام / مل) ، يجب أن تكون مجهزة لاستعمال غير الخطية أربعة المعلمة لوجستية (4 - PL) مؤامرة المعادلة (1) (سيغما باستخدام قطعة أو 8.0 Kaleidagraph). يعتمد عادة غير الخطية 4 - PL نموذج لوصف المقايسات ملزم يجند (LBAs) 6.

المعادلة 1 (1)
أ ، ب ، X0 ، y0 معلمات اللوجستي والتي قدمها البرنامج مؤامرة سيغما تناسب المنحنى.
استخدام صيغة لحساب يفسر من محتوى HT-2/T-2 السم المبلغ الإجمالي في حل استخراج عينة المخففة
المعادلة 2 (2)
x هو تركيز كتلة من المبلغ الإجمالي للHT-2/T-2 السموم في حل استخراج المخفف ، وتحسب من المعادلة 4 معلمات لوجستية في نانوغرام لكل milliltre (نانوغرام / مل)
y هو القيمة الحالية في أمبير الحصول على عينة غير معروفة

ملحق

6) المغناطيسي الخرز المغلفه

المضي قدما على النحو التالي أن يكون مطلي الخرز المغناطيسي :

الغسيل الداخلي

  1. التجانس Dynabeads tosylactivated ® M - 280 (2 × الأسهم حل حبات 109 / مل) من الهز وvortexing (سرعة قصوى) لمدة 1 دقيقة (تجنب الرغوة) (يرجى ملاحظة تركيز حبات المغناطيسي يجب أن يكون دائما هو نفسه لضمان تكرارية في قياس) ؛
  2. ماصة فورا 1 مل من الخرز والمتجانس أعلاه في أنبوب 2 مل إيبندورف ؛
  3. وضع أنبوب في الجسيمات المغناطيسية المكثف مع الجزء المغناطيسي وضعت على لمدة 2 دقيقة (انظر الخرز المغناطيسي شائكة على الجدار الجانبي للأنبوب) ؛
  4. ماصة بعناية قبالة طاف ، تاركا حبات دون عائق ؛
  5. إزالة أنبوب إيبندورف المكثف من الجسيمات المغناطيسية وresuspend حبات في 1 مل من 0.1 درجة الحموضة عازلة M بورات 9.5. المزيج برفق لمدة 2 دقيقة في الخلاط عينة بالتناوب لمدة 2 دقيقة ؛
  6. ماصة قبالة طاف ؛
  7. ماصة 1 مل من محلول بورات عازلة داخل الأنبوب إيبندورف. الخرز المغناطيسي على استعداد الآن للخطوة الطلاء ؛

طلاء الداخلي

  1. إضافة 600 مل من HT - 2 مترافق مع الحل KLH الأسهم (الخادم Keyhole هيموسيانين بطلينوس) إلى 1 مل من الخرز المغناطيسي) (نهائي HT - 2 - KLH تركيز 375 ملغ / مل) ؛ الخرز المغناطيسي احتضان والحل HT - 2 - لKLH 20h عند 37 درجة مئوية * مع دوران بطيء على الميل الدورية خلاط نموذج ؛
  2. بعد مكان الحضانة الأنبوب المكثف في الجسيمات المغناطيسية وماصة قبالة طاف ؛
    تغسل حبات مغلفة مرتين مع 1 مل من محلول العازلة PBS / جيش صرب البوسنة. بين كل غسيل إزالة PBS / BSA الحل. أجريت كل خطوة الغسيل وضع الخرز المغناطيسي وPBS / جيش صرب البوسنة على خلاط الدورية لمدة 5 دقائق ؛
  3. تغسل حبات المغناطيسي به مرة واحدة 1 مل من محلول العازلة TRIS / جيش صرب البوسنة. إزالة TRIS / حل جيش صرب البوسنة. القيام بهذه الخطوة عن طريق وضع الخرز المغناطيسي والعازلة TRIS / جيش صرب البوسنة على الدورية خلاط لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية * ؛
  4. تغسل حبات المغناطيسي مرة واحدة باستخدام 1ml من منتعشة (يحتفظ بها في الثلاجة على 4 درجات مئوية) PBS / BSA حل العازلة. إزالة PBS / BSA الحل. تنفيذ هذه الخطوة وضع الخرز المغناطيسي والعازلة PBS / جيش صرب البوسنة على الدورية للخلاط 5min في درجة حرارة الغرفة ؛
  5. بعد الغسيل السائل الخطوة إزالة كافة الغسيل وإضافة 1 مل PBS العازلة نان + 3 + جيش صرب البوسنة وتخزين السائل ؛
  6. تخزين حبات المغناطيسي المغلفة في 4 درجات مئوية (يرجى ملاحظة أن حبات المغناطيسي المغلفة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أشهر على 4 درجات مئوية) ؛

* ولهذا الغرض يوضع في الفرن خلاطة مجهزة حفرة الذي يسمح للالإدراج من كابل لامدادات الطاقة. بدلا من ذلك يمكن أن يوضع في الخلاط في غرفة thermostated عند 37 درجة مئوية.

7) إعداد واستخراج عينة

25 غ من العينة المطحون ناعما (أغذية الأطفال أو الفطور الحبوب) نحنighed في وعاء الخلاط وانتزعت مع 100 مل من أسيتونتريل / المحلول المائي (86/14) لمدة 3 دقائق في خلاط عالية السرعة. بعد الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة (3000 ز) لمدة 5 دقائق ، اتخذت 8 مل من طاف وتنقيته مع العمود Mycosep ، والمجففة 4 مل من مستخلص تنظيفها تحت تدفق النيتروجين. ويمكن تخزين العينات المجففة في -30 درجة مئوية تصل إلى عدة أشهر.

8) إعادة تشكيل نموذج

إفطار الحبوب

إعادة تشكيل حبوب الافطار المجففة استخراج (الغذائية من الحبوب المخصصة للاستهلاك تستند الكبار) مع 40 مل من الحموضة PBS 7.4. بهذه الطريقة سوف عينة مع تركيز السم المساواة القانونية للحد من المفترض (200 نغ / غ) في خطوة تعطي قياس إشارة سقوطه في منتصف نطاق العمل.

طعام للأطفال

إعادة تشكيل أغذية الأطفال المجففة استخراج (الغذائية من الحبوب المخصصة للاستهلاك تستند الرضع) مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. بهذه الطريقة سوف عينة مع التركيز على قدم المساواة من السموم للحد من المفترض القانونية (20-25 نانوغرام / غرام) في خطوة تعطي إشارة القياس التي سقطت في منتصف نطاق العمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد شهد استخدام الأجسام المضادة وتحقيق الاعتراف الجزيئية البيولوجية استخدام تقنيات الاستشعار عن بعد على نطاق واسع ل؛ منهجيات الكشف immunochemical ، مثل ELISAs وMEIAs ، هي ، في الوقت الحاضر ، من بين المنصات المستخدمة وتطبيقها في العديد من المختبرات 7.

في حين أن هذه المناهج تحقيق حساسية وخصوصية استثنائية ، وهو الهدف الرئيسي للمجموعات بحثية عديدة في السنوات الماضية في تحسين وتحسين أدائهم.

في هذا البروتوكول أظهرنا كيفية تلفيق واستجواب an immunosensor الكهروكيميائية للكشف بالسموم الفطرية. نحن نعتقد أن استخدام الكهربائية لتطوير مناعة المستندة إلى أجهزة الاستشعار وسوف يثبت أن أهمية متزايدة في المستقبل. هذا يرجع إلى المزايا المتأصلة في الكشف عن أكثر من واحد الكهروكيميائية الضوئية. الكيمياء الكهربائية هي في الواقع أقل عرضة للتدخلات قوية وأثبتت بشكل ملحوظ ضد الامتزاز غير محددة وأداء جيد حتى عندما تحدى في مصفوفات العينة معقدة مثل حبوب الافطار وbabyfood. علاوة على ذلك ، هو أكثر ملاءمة الكهربائية إلى التصغير ومتعددة مجموعة التكيف.

وقد تحسنت اقتران هذا النهج مع النانوية المغناطيسية أيضا الأداء التحليلي ولقد ثبت أن تكون مناسبة بشكل خاص للكشف عن الملوثات في عينات من المواد الغذائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

والكتاب أود أن أشكر نانسي داونر وجميع أعضاء من مختبر الكيمياء التحليلية من جامعة روما "تور فيرغاتا" للتعاون والدعم اللوجستي. وأيد هذا العمل من قبل "BioCop" مشروع الاتحاد الأوروبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich S3264
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
MgCl2 anhydrous Sigma-Aldrich M8266
DEA (99.5%) Sigma-Aldrich 31589
HCl 37% Sigma-Aldrich 320331
H3BO3 Sigma-Aldrich B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane Sigma-Aldrich 252859
BSA (albumin bovine serum) Sigma-Aldrich A4503
NaOH Sigma-Aldrich S5881
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416
NaN3 Aldrich 71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt Fluka N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk Bio-Rad 170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): Biopure 004050 The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. Vector Laboratories AP-2000
HT-2 toxin Biopure
Magnetic beads: Dynabeads® Invitrogen M-280 Tosylactivated Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05% Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1% Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S Invitrogen
PalmSens instrument PalmSens Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer PalmSens
Eight channel Mux electric contact hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) hand made
Specially designed support for electrodes strip hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes. Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml. Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch, P. State of the art of trichothecenes analysis. Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).
  2. Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
  3. Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. 263-271 (2008).
  4. FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
  5. Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
  6. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9, (2), E260-E267 (2007).
  7. Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605, (2), 111-129 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics