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ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic électrochimique) Méthode de détection des mycotoxines

Biology

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Summary

Un protocole pour détecter les trichothécènes (mycotoxines de préoccupation pour la santé humaine) en utilisant une méthode de dépistage nouvellement développé basé sur une méthode immunochimique compétitifs et une détection électrochimique dernière est démontrée.

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Romanazzo, D., Ricci, F., Vesco, S., Piermarini, S., Volpe, G., Moscone, D., Palleschi, G. ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection. J. Vis. Exp. (32), e1588, doi:10.3791/1588 (2009).

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Abstract

Les immunoessais sont une alternative valable à la plus coûteuse en temps et consommer HPLC quantitative ou GC 1, 2 méthodes de dépistage pour la détection de mycotoxines dans les denrées alimentaires dangereuses. Dans ce protocole, nous montrons comment fabriquer et d'interroger une enzyme électrochimique de dosage immuno-concurrentiel lié basé sur l'utilisation de billes magnétiques comme support solide pour la chaîne immunochimiques 3 et électrodes sérigraphiées que la détection de la plate-forme.

Notre méthode vise à déterminer la quantité totale de HT-2 et T-2 toxines, les mycotoxines appartenant à la famille des trichothécènes et de grande préoccupation pour la santé humaine 4. L'utilisation d'un clone d'anticorps avec une réactivité croisée de 100% vers la HT-2 et T-2 permet de détecter simultanément deux toxines avec une sensibilité similaire 5.

La première étape de notre analyse est l'étape de revêtement où nous immobilisent toxine conjugué HT2-KLH sur la surface de billes magnétiques. Après une étape de blocage, nécessaire pour éviter les absorptions non spécifiques, l'ajout d'un anticorps monoclonal permet la concurrence entre immobilisé HT-2 et HT-2 gratuitement ou T-2 présents dans l'échantillon ou dissous dans une solution standard.

A la fin de l'étape la concurrence, la quantité d'anticorps monoclonaux liés à l'immobilisation HT-2 sera inversement proportionnelle à la quantité de toxine dans la solution échantillon.

Un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (AP) est utilisée pour révéler la liaison entre l'anticorps spécifique et l'immobilise HT-2. L'étape finale est effectuée la mesure par la chute d'une partie aliquote de la suspension de billes magnétiques, correspondant à un échantillon / solution de norme spécifique, sur la surface d'un écran-imprimés électrode de travail; billes magnétiques sont immobilisés et concentré au moyen d'un aimant placé exactement sous le sérigraphié électrode. Après deux minutes d'incubation entre les billes magnétiques et un substrat pour l'AP, le produit enzymatique est détecté par Differential Pulse Voltamétrie (DPV) en utilisant un instrument portatif (PalmSens) également en mesure de lancer automatiquement les huit mesures dans un intervalle de quelques secondes.

Protocol

1) Le blocage des billes magnétiques revêtues:

Procédez comme suit pour bloquer billes magnétiques recouvertes:

  1. Préparer un ensemble de deux tubes Eppendorf ml;
  2. Homogénéiser (secousses, mais pas vortex) de billes magnétiques recouvertes (voir l'annexe pour la préparation des billes magnétiques recouvertes) en utilisant l'échantillon tournant mélangeur;
  3. Immédiatement après homogénéisation, une pipette 10 ul de billes magnétiques recouvertes dans chaque tubes Eppendorf distinctes;
  4. Ajouter 1 ml de lait écrémé en solution de blocage dans chacun des tubes Eppendorf de l'ensemble;
  5. Laissez les billes magnétiques incuber pendant 30 min à température ambiante sur le mélangeur de l'échantillon en rotation;
  6. Retirer la solution de blocage: pour ce faire placer le tube dans concentrateur de particules magnétiques avec la partie magnétique mis sur pendant 2 min (voir billes magnétiques coller sur la paroi latérale du tube); soigneusement la pipette le surnageant en laissant intactes perles;
  7. Ajouter 1 ml de tampon PBS + NaN 3 + BSA comme solution de stockage pour chaque tube;
  8. Magasin de revêtement et bloqué les billes magnétiques à 4 ° C (s'il vous plaît noter que des billes magnétiques revêtues sont stables pendant au moins 2 mois à 4 ° C);

2) de la chaîne immunologiques sur des billes magnétiques pour la construction de la courbe d'étalonnage et d'analyse d'échantillon

Procédez comme suit pour avoir des billes magnétiques prêt pour la mesure:

  1. Prenez un tube Eppendorf (2 ml) de solution de revêtement et bloquées pour chaque extrait de l'échantillon que vous allez à analyser;
  2. Prenez un tube supplémentaire pour chaque Eppendorf solution d'étalonnage de travail;
  3. Homogénéiser les billes magnétiques pendant 2 min sur le mélangeur échantillon tournant avant utilisation;
  4. Retirer le liquide de stockage en utilisant concentrateur de particules magnétiques;
  5. Laver les billes magnétiques à trois reprises avec la solution de lavage PBS / BSA. Retirer liquide de lavage;
  6. Étape du concours: Ajouter à chaque tube contenant les billes lavées magnétiques, 200 pl de l'échantillon extrait préparé; utiliser un tube de bille magnétique pour chaque échantillon. Répétez la même procédure pour chaque solution standard. Ajouter 200 pi de solution d'anticorps monoclonaux pour chaque tube bille magnétique. Laissez les billes magnétiques incuber pendant une demi-heure sur la table de mixage échantillon tournant à température ambiante;
  7. Retirer de tubes Eppendorf la solution utilisée pour la compétition-étape;
  8. Étiquetage étape: Ajouter 400μl d'anticorps secondaire marqué à chaque tube Eppendorf bille magnétique. Laissez les billes magnétiques incuber pendant une demi-heure sur la table de mixage échantillon tournant à température ambiante;
  9. Enlever étiquette de la solution provenant de tubes Eppendorf;
  10. Laver les billes magnétiques à trois reprises avec du PBS / Tween ® 20 solution de lavage. Retirer du liquide;
  11. Resuspendre avec 100 pi de tampon DEA chaque aliquote de billes magnétiques. Maintenant, les billes magnétiques sont prêts pour l'étape de mesure électrochimique;

3) Assemblée des PalmSens avec le multiplexeur (MUX) des options

S'il vous plaît noter: produits d'hydrolyse enzymatique du substrat fautes de la surface de l'électrode, pour cette raison une nouvelle électrode est nécessaire pour chaque mesure.

  1. Connecter un PC portable à PalmSens par le câble série;
  2. Connectez la prise DIN du 9-CH8 multiplexeur avec PalmSens.
  3. Branchez le câble série de huit canaux de contact électrique avec Mux CH8 Multiplexeur;
  4. Bande d'électrode place sur le bloc aimant huit. Prêtez attention à placer chaque aimant sous chaque électrodes de travail (à noter, la nécessité d'un aimant unique pour chaque électrode est impératif sinon les particules magnétiques ne sera pas concentré sur la zone des électrodes de travail);
  5. Branchez la bande électrodes en huit canaux contact électrique Mux;

Pour la mesure DPV utiliser les paramètres suivants dans les cases appropriées:
E commencer: 0 (V); fin E: 0,6 (V); étape E: 0,016 (V); impulsion E: 0,0339 (V); E conditionné: le taux de numérisation;:; 0 (V) 0 (V) E dépôt : 0,1 (V / s); T impulsion: 0,06 (s); conditionné T: 0 (s); dépôt T: 0 (s); équilibration T: 8 (s).

4) la réaction enzymatique et mesure électrochimique

  1. Homogénéiser en agitant chaque tube Eppendorf contenant des billes magnétiques prêt pour l'étape de mesure électrochimique afin d'obtenir une suspension bien dispersée de billes magnétiques;
  2. Pipette de chaque Eppendorf, immédiatement après homogénéisation, une aliquote de 20 ul de la dispersion par billes magnétiques sur la surface de l'électrode de travail correspondant. Pour chaque électrode d'une utilisation de bande 20 ul de billes magnétiques provenant des tubes Eppendorf différents (par exemple l'utilisation d'électrodes pour huit huit différents Eppendorf);
  3. Ajouter 80 ul de solution de substrat enzymatique sur la première électrode. Démarrer 2 min décompte. Après 14 secondes, ajouter 80 ul de solution de substrat enzymatique sur la deuxième électrode. Après 14 secondes supplémentaires, ajouter 80 ul de solution de substrat enzymatique sur la troisième électrode. Procéder à l'int en même tempsErval (14 secondes) jusqu'à la dernière électrode (ce qui signifie: déposer chaque aliquote de substrat avec des intervalles de 14 secondes). L'intervalle de temps de 14 sec est calculée comme le temps requis par le potentiostat pour effectuer la mesure; à noter, la solution 80 ul de chaque capteur doit couvrir l'électrode de travail, de référence et de contre. Par ailleurs, les solutions pour chaque capteur ne doit pas entrer en contact avec des solutions d'électrodes voisines.
  4. Après les 2 min décompte de la première addition de solution de substrat enzymatique, lancer la mesure électrochimique;
  5. Utilisez le PalmSens Lite logiciel pour obtenir des pics de courant (mA) pour chaque solution.

5) Calcul

Établir une courbe d'étalonnage en utilisant une équation logistique à 4 paramètres et de calculer la concentration du total des HT-2/T-2 montant de toxine en nanogrammes par millilitre pour chaque tube Eppendorf contenant l'échantillon inconnu.

Les données expérimentales, la hauteur du pic (uA) contre la concentration de l'calibrants (ng / ml), doivent être équipés avec un non-linéaire à quatre paramètres logistiques (4-PL) tracer l'équation (1) (en utilisant Terrain Sigma 8.0 ou Kaleidagraph). Le non-linéaire 4-PL modèle est généralement adopté pour décrire les essais de liaison du ligand (LBA) 6.

L'équation 1 (1)
a, b, x0, y0 sont des paramètres logistiques comme donné par le programme tracé Sigma ajustement de la courbe.
Utilisez la formule explicitées pour calculer la teneur des HT-2/T-2 montant total de toxines dans la solution d'extrait échantillon dilué
Équation 2 (2)
x est la concentration massique de la quantité totale de toxines HT-2/T-2 dans la solution d'extrait dilué, calculé à partir de l'équation logistique à 4 paramètres en nanogramme par milliltre (ng / ml)
y est la valeur actuelle en uA obtenus pour l'échantillon inconnu

Annexe

6) de billes magnétiques recouvertes

Procédez comme suit pour avoir des billes magnétiques revêtues:

Procédure de lavage

  1. Homogénéiser Dynabeads tosylactivated ® M-280 (solution stock 2 x 109 billes / ml) en agitant et en vortex (vitesse max) pendant 1 min (éviter de faire mousser) (S'il vous plaît noter la concentration de billes magnétiques a besoin d'être toujours le même pour assurer la reproductibilité de la mesure);
  2. Immédiatement pipette de 1 ml de billes au-dessus homogénéisé dans un tube Eppendorf de 2 ml;
  3. Placer le tube dans concentrateur de particules magnétiques avec la partie magnétique mis sur pendant 2 min (voir billes magnétiques coller sur la paroi latérale du tube);
  4. Soigneusement pipette le surnageant en laissant intactes perles;
  5. Retirez le tube Eppendorf du concentrateur de particules magnétiques et remettre en suspension les perles dans 1 ml de 0,1 M pH tampon borate 9,5. Mélanger doucement pendant 2 min dans le mélangeur échantillon tournant pendant 2 min;
  6. Pipeter le surnageant;
  7. Pipeter 1 ml de solution tampon de borate dans le tube Eppendorf. Les billes magnétiques sont maintenant prêtes pour l'étape d'enrobage;

Procédure de revêtement

  1. Ajouter 600 ml de HT-2 conjugué avec une solution stock de KLH (Keyhole Limpet Keyhole) à 1 ml de billes magnétiques) (dernière HT-2-KLH concentration de 375 mg / ml); incubation des billes magnétiques et HT-2-KLH solution pour 20h à 37 ° C * avec une rotation lente sur le tilt rotation mélangeur d'échantillons;
  2. Après une incubation lieu le tube dans le concentrateur de particules magnétiques et la pipette le surnageant;
    Lavez billes revêtues deux fois avec 1 ml de solution tampon PBS / BSA. Entre chaque lavage retirer PBS / BSA solution. Toutes les étapes de lavage ont été effectués mise en billes magnétiques et PBS / BSA sur mélangeur rotatif pendant 5 min;
  3. Laver les billes magnétiques fois en utilisant 1 ml de solution tampon Tris / BSA. Retirer TRIS / solution de BSA. Effectuer cette étape en fixant des billes magnétiques et TRIS / BSA tampon sur tournante mélangeur pendant 4 h à 37 ° C *;
  4. Laver les billes magnétiques fois en utilisant 1 ml de rafraîchi (conservés au réfrigérateur à 4 ° C) PBS / BSA solution tampon. Retirer du PBS / BSA solution. Effectuer cette étape de réglage des billes magnétiques et de tampon PBS / BSA sur la rotation de mixage pour 5min à température ambiante;
  5. Après l'étape de lavage supprimer tous les liquides de lavage et ajouter 1 ml de tampon PBS + NaN 3 + BSA comme liquide de conservation;
  6. Magasin de billes magnétiques recouvertes à 4 ° C (s'il vous plaît noter que des billes magnétiques revêtues sont stables pendant au moins 2 mois à 4 ° C);

* A cet effet, le mélangeur est placé dans un four équipé d'un trou qui permet l'insertion du câble pour l'alimentation. Alternativement, le mélangeur peut être placé dans une chambre thermostatée à 37 ° C.

La préparation des échantillons 7) et l'extraction

25 g d'échantillon finement broyé (céréales pour bébés nourriture ou petit déjeuner), nous sommesighed dans un récipient du mélangeur et extrait avec 100 ml d'acétonitrile / solution d'eau (86/14) pendant 3 min dans un mélangeur à haute vitesse. Après centrifugation à 4000 rpm (3000 g) pendant 5 min, 8 ml de surnageant ont été prélevés et purifiés avec colonne Mycosep, 4 ml de l'extrait nettoyées ont été séchés sous flux d'azote. Échantillons séchés peuvent être stockés à -30 ° C jusqu'à plusieurs mois.

8) la reconstitution échantillon

Céréales pour petit déjeuner

Reconstituer l'extrait le petit déjeuner de céréales sèches (nourriture à base de céréales destinés à la consommation des adultes) avec 40 ml de PBS pH 7,4. De cette manière, un échantillon avec une concentration de toxine égale à la limite légale supposée (200 ng / g) donnera à l'étape de mesure d'un signal tombant au milieu de la plage de travail.

La nourriture pour bébé

Reconstituer l'extrait sec d'aliments pour bébés (aliments à base de céréales destinés à la consommation infantile) avec 4 ml de PBS. De cette manière, un échantillon avec une concentration de toxines égale à la limite légale supposée (20-25 ng / g) donnera à l'étape de mesure d'un signal tombant au milieu de la plage de travail.

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Discussion

L'utilisation d'anticorps comme sonde de reconnaissance biomoléculaire a vu une utilisation généralisée des technologies de détection; méthodes de détection immunochimiques, tels que ELISA et MEIAs, sont, aujourd'hui, parmi les plateformes les plus utilisées et appliquées dans de nombreux laboratoires 7.

Bien que ces approches obtenir une sensibilité et une spécificité exceptionnelle, un objectif premier de nombreux groupes de recherche dans les dernières années a été l'amélioration et l'optimisation de leurs performances.

Dans ce protocole, nous avons montré comment fabriquer et d'interroger une immunocapteur électrochimiques pour la détection des mycotoxines. Nous croyons que l'utilisation de l'électrochimie à développer l'immuno-capteurs à base va se révéler d'une importance croissante dans l'avenir. Cela est dû à des avantages inhérents de détection électrochimique sur celui optique. Electrochimie est en effet moins enclins à les interférences et s'est avérée remarquablement robuste contre l'adsorption non-spécifique et bien performer même lorsque contestée dans les matrices d'échantillons complexes tels que les céréales de petit déjeuner et aliments pour bébés. Par ailleurs, l'électrochimie est plus adaptée à la miniaturisation et à la multi-réseau d'adaptation.

Le couplage d'une telle approche avec des nanoparticules magnétiques ont également amélioré les performances analytiques et se sont avérées particulièrement adaptées pour la détection de contaminants dans les échantillons alimentaires.

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Acknowledgements

Auteurs tiens à remercier Nancy Downer et tous les membres du laboratoire de Chimie Analytique, Université de Rome "Tor Vergata" pour leur collaboration et le soutien logistique. Ce travail a été soutenu par le projet européen "BioCop".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich S3264
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
MgCl2 anhydrous Sigma-Aldrich M8266
DEA (99.5%) Sigma-Aldrich 31589
HCl 37% Sigma-Aldrich 320331
H3BO3 Sigma-Aldrich B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane Sigma-Aldrich 252859
BSA (albumin bovine serum) Sigma-Aldrich A4503
NaOH Sigma-Aldrich S5881
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416
NaN3 Aldrich 71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt Fluka N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk Bio-Rad 170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): Biopure 004050 The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. Vector Laboratories AP-2000
HT-2 toxin Biopure
Magnetic beads: Dynabeads® Invitrogen M-280 Tosylactivated Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05% Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1% Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S Invitrogen
PalmSens instrument PalmSens Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer PalmSens
Eight channel Mux electric contact hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) hand made
Specially designed support for electrodes strip hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes. Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml. Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.

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References

  1. Koch, P. State of the art of trichothecenes analysis. Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).
  2. Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
  3. Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. 263-271 (2008).
  4. FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
  5. Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
  6. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9, (2), E260-E267 (2007).
  7. Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605, (2), 111-129 (2007).

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