ऊतक इंजीनियरिंग के लिए 3 डी Hydrogels में सेलुलर इनकैप्सुलेशन

Biology
 

Summary

हम सिंथेटिक hydrogels के भीतर कोशिकाओं के 3 आयामी (3 डी) encapsulation के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित थे. encapsulation प्रक्रिया crosslinking के दो सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों (माइकल प्रकार अलावा और प्रकाश शुरू मुफ्त कट्टरपंथी तंत्र), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समझाया सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए तकनीकों का एक नंबर के लिए उल्लिखित है.

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Khetan, S., Burdick, J. Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering . J. Vis. Exp. (32), e1590, doi:10.3791/1590 (2009).

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Abstract

Hydrogels के भीतर कोशिकाओं के 3 डी encapsulation के संवर्धन कोशिकाओं के लिए और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए constructs के विकास की दिशा में एक तेजी से महत्वपूर्ण और लोकप्रिय तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है. इस माहौल को बेहतर mimics क्या कोशिकाओं vivo में निरीक्षण, मानक टिशू कल्चर की तुलना में ऊतक की तरह गुणों और 3 डी वातावरण की वजह से. सिंथेटिक polymeric hydrogels पानी सूजन नेटवर्क है कि स्थिर हो या hydrolysis या proteolysis के माध्यम से नीचा है के रूप में नए ऊतक समझाया कोशिकाओं द्वारा जमा है बनाया जा सकता है है. पॉलिमर की एक विस्तृत विविधता इन अनुप्रयोगों के लिए पाली (ethylene glycol) और hyaluronic एसिड के रूप में पता लगाया गया है. सबसे अधिक, बहुलक जैसे methacrylates या acrylates विभिन्न तंत्र के माध्यम से crosslinking के दौर से गुजर में सक्षम प्रतिक्रियाशील समूहों के साथ functionalized है. पिछले दशक में, बहुत प्रगति इन microenvironments इंजीनियरिंग में बनाया गया है - व्यवहार्यता और प्रत्यक्ष समझाया स्टेम कोशिकाओं (. Burdick एट अल) के भेदभाव सहित सेलुलर phenotype, सुधार - जैसे शारीरिक या लटकन जैव रासायनिक संकेत के सहसंयोजक समावेश के माध्यम से.

हमारे और अन्य प्रयोगशालाओं में कोशिकाओं के 3 डी encapsulation के लिए निम्नलिखित तरीकों अनुकूलित किया गया है cytocompatibility अधिकतम और hydrogel प्रसंस्करण कदम की संख्या कम से कम. निम्नलिखित प्रोटोकॉल (प्रक्रिया का एक उदाहरण के लिए चित्रा 1 देखें) में, यह माना जाता है कि functionalized crosslinking के दौर से गुजर में सक्षम पॉलिमर हाथ में पहले से ही कर रहे हैं, बहुलक रसायन शास्त्र के रूप में ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र के लिए लागू की उत्कृष्ट समीक्षाएँ कहीं और पाया जा सकता है (Burdick एट अल.) और इन तरीकों बहुलक प्रकार की एक सीमा के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, माइकल प्रकार (Lutolf एट अल देखें.) के अलावा और प्रकाश शुरू मुफ्त कट्टरपंथी तंत्र (Elisseeff एट अल देखें.) यहाँ पर ध्यान केंद्रित रिपोर्ट crosslinking तकनीक के केवल एक छोटे से हिस्से का गठन . मिश्रित मोड crosslinking में जो प्रतिक्रियाशील समूहों के एक हिस्से को पहले इसके अलावा crosslinking द्वारा भस्म हो जाता है और एक कट्टरपंथी तंत्र द्वारा पीछा किया, समझाया कोशिकाओं (खेतान एट अल, सेलिनास एट अल.) के phenotype निर्देशन के लिए एक प्रतिमान आमतौर पर इस्तेमाल किया और शक्तिशाली है.

Protocol

ए सामग्री तैयार करना और बंध्याकरण

  1. तैयारी encapsulation सामग्री के लिए पहले 2959 Irgacure फॉस्फेट में photoinitiator (I2959) के एक 0.5% wt समाधान तैयार करने के लिए खारा buffered (पीबीएस) द्वारा मिश्रण और 37 में कई दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए incubating समाधान तो सिरिंज बंध्याकरण के लिए फ़िल्टर और लंबी अवधि के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
  2. संश्लेषित किया जा जैल के वांछित संरचना के आधार पर, (Microsoft एक्सेल जैसे स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करके) की गणना बहुलक और crosslinker के वजन की जरूरत है. क्योंकि बहुलक का एक भी वजन hydrogels, crosslinker और बहुलक जेल की कुल मात्रा का समाधान भाग में एक वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के एक परिभाषित कुल मात्रा में भंग किया जाना चाहिए भी स्प्रेडशीट का उपयोग करके निर्धारित होना चाहिए. इसी प्रकार गणना अगर किसी भी लटकन moieties (जैसे, एक चिपकने वाला RGD या oligopeptide युक्त YGSR) crosslinking से पहले शामिल हो रहे हैं बनाया जाना चाहिए.
  3. Eppendorf ट्यूबों में बहुलक और crosslinker के लिए आवश्यक राशि और जगह वजन. प्राप्त बहुलक का वास्तविक वजन के लिए गणना स्प्रेडशीट तदनुसार समायोजित. (नोट: मात्रा प्राप्त बहुलक और crosslinker की वास्तविक जन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए बदला जा सकता है).
  4. सबसे ऊपर व्यक्तिगत लिपटे बाँझ 1 एमएल डिस्पोजेबल सीरिंज की काट के लिए एक धार का उपयोग करके जेल molds तैयार. सुनिश्चित करें एक फ्लैट में कटौती photopatterned जैल के लिए इस्तेमाल किया जा molds के लिए किया जाता है.
  5. सिरिंज molds, Eppendorf ट्यूबों (टोपियां खुला के साथ) और एक germicidal प्रकाश स्रोत (आमतौर पर जैविक सुरक्षा अलमारियाँ में बनाया) के नीचे किसी भी अन्य आवश्यक सामग्री प्लेस और 30 मिनट के लिए बाँझ.

बी सेल तैयार

  1. नसबंदी के बाद, उपयुक्त बाँझ बफर मात्रा जोड़ने के लिए (स्प्रेडशीट गणना के अनुसार,, Pbs, जबकि बफर की पसंद भिन्न कर सकते हैं और triethanolamine के रूप में एक कमजोर आधार बफर आम तौर पर मुक्त कट्टरपंथी और माइकल प्रकार crosslinking, क्रमशः के लिए इस्तेमाल किया जाता है) बहुलक Eppendorf और लटकन (वैकल्पिक) को शामिल किया आधा भाग (जैसे, चिपकने वाला पेप्टाइड) और भंग भंवर (अगर parafilm साथ बाँझ हुड लपेटो बाहर Eppendorf vortexing).
  2. बहुलक समाधान के लिए लटकन आधा भाग समाधान का उचित मात्रा में जोड़ें और parafilm के साथ सील लपेटो. संक्षेप में भंवर और 37 में सेल की तैयारी के दौरान सेते डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया के लिए (यदि संभव हो तो, एक रोटरी हलचल की थाली के ऊपर). यह एक पेप्टाइड पर thiol की प्रतिक्रिया एक acrylate या methacrylate (सिस्टीन समूह के माध्यम से) शामिल है इतना है कि पेप्टाइड अंतिम hydrogel में एक लटकन समूह के रूप में शामिल है.
  3. Trypsinize और कोशिकाओं और जैल के प्रत्येक सेट के लिए उपयुक्त संख्या युक्त भागों में अलग गिनती. उदाहरण के लिए, 10 मिलियन कोशिकाओं / एमएल, एक व्यक्ति शंक्वाकार ट्यूब में अलग - अलग 1.5 मिलियन कोशिकाओं के घनत्व में तीन 50 μL जैल का एक सेट के लिए. यह अनुशंसा की जाती है कि चार से अधिक नहीं जैल जमाना के समय (ध्यान दें: अगर जैल के एकाधिक सेट synthesizing, एक एकल Eppendorf बहुलक समाधान के सभी सेट के लिए पर्याप्त मात्रा युक्त तैयार किया जा सकता है) के कारण एक व्यक्ति सेट में तैयार किया जाना है.
  4. कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  5. जबकि कोशिकाओं नीचे कताई रहे हैं
    1. लाइट मुफ्त कट्टरपंथी crosslinking शुरू: कुल जेल निर्धारित मात्रा का 10% (0.05% wt के अंतिम आरंभकर्ता एकाग्रता के लिए) बराबर बहुलक समाधान के लिए 0.5% wt I2959 समाधान जोड़ने .
    2. माइकल प्रकार crosslinking (अलावा): crosslinker बफर जोड़ने के लिए उपयुक्त एकाग्रता समाधान प्राप्त करने के.
    3. अनुक्रमिक crosslinking के लिए: इन जैल crosslinking के दोनों प्रकार के शामिल है और पिछले चरणों की दोनों की आवश्यकता है .

सी. Hydrogel गठन

  1. Centrifuged सेल भाग से सतह पर तैरनेवाला Aspirate. तरल के लिए रुको प्रारंभिक आकांक्षा और फिर से aspirate के बाद व्यवस्थित करने के लिए सेल गोली बाधा पहुँचा के बिना जितना संभव हो उतना मीडिया को दूर.
  2. बहुलक समाधान के साथ सेल गोली Resuspend जब तक कोशिकाओं समान रूप से वितरित कर रहे हैं. धीरे समाधान pipetting ऊपर बुलबुला गठन न्यूनतम और नीचे (लगभग 10 चक्र कोशिकाओं को वितरित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए).
  3. Crosslinking Hydrogels
    1. : लाइट मुफ्त कट्टरपंथी crosslinking विभाज्य सिरिंज टिप molds में उचित मात्रा को शुरू की . पराबैंगनी प्रकाश में कट्टरपंथी crosslinking के लिए सिरिंजों को बेनकाब (उदाहरण के लिए, एक 10 मिनट 365 एनएम के लिए जोखिम, 4 mW/cm2 यूवी प्रकाश acrylate functionalized पॉलिमर के लिए आम है). इस कदम को तेजी से सेल यूवी प्रकाश जोखिम से पहले निपटाने के कम से कम किया जाना चाहिए.
    2. माइकल प्रकार crosslinking (अलावा): एक विस्तृत छिद्र विंदुक टिप का उपयोग, समाधान / बहुलक सेल crosslinker समाधान के उचित मात्रा में जोड़ने, वांछित व्यक्ति जेल मात्रा विंदुक सेट, समाधान विंदुक ऊपर और नीचेhomogenize, और सिरिंज टिप molds में विभाज्य. इस कदम को तेजी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए करने के लिए कक्षों की एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए. Crosslinking के लिए संस्कृति हुड में 10-30 मिनट (निजी सिस्टम पर निर्भर करता है) ऊष्मायन की अनुमति दें.
    3. अनुक्रमिक crosslinking: यह माइकल प्रकार अलावा पहली प्रतिक्रिया और फिर दूसरे crosslinking के लिए प्रकाश जोखिम शामिल है . केवल सैद्धांतिक crosslinks का एक अंश पहली crosslinking के दौरान प्रतिक्रिया व्यक्त होना चाहिए और फिर एक बाँझ मुखौटा जेल सतह को सीधे जाना चाहिए प्रकाश निष्फल चिमटी का उपयोग कर जोखिम से पहले लागू है. एक functionalized डाई (उदाहरण के लिए, 20 एनएम के जेल में एक अंतिम एकाग्रता में methacrylated rhodamine (MeRho)) भी प्रारंभिक patterning कल्पना समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है, क्योंकि यह preferentially जेल के मौलिक Crosslinked क्षेत्रों में शामिल होगा (चित्रा 2 ).

डी. सेल संस्कृति और विश्लेषण

  1. निम्नलिखित crosslinking, एक टिशू कल्चर ऊष्मायन और विश्लेषण के लिए मीडिया युक्त थाली के कुओं (देखने के लिए निम्न चरणों का) में डुबकी जैल.
  2. और व्यवहार्यता का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट धुंधला / रहते मृत किट (आंकड़े 3 और 4), कक्ष आकारिकी प्रकाश माइक्रोस्कोपी (आमतौर पर, संश्लेषित hydrogels पारदर्शी होते हैं चित्रा 3) का उपयोग करने के लिए कल्पना की जा सकता है. सेलुलर (जैसे rhodamine, या fluorescein लेबल phalloidin) actin और नाभिक के लिए धुंधला हो जाना (जैसे, 4'-6 Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) निम्न प्रक्रिया के साथ मानक निर्धारण और permeabilization प्रक्रियाओं (चित्रा 4) का उपयोग किया जा सकता है.
    1. पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3X constructs कुल्ला.
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1 एमएल 4% formaldehyde में ऊष्मायन से ठीक जैल.
    3. कुल्ला अवरुद्ध 3 (w / v)% BSA और 0.5% (w / v) पीबीएस में बीच युक्त समाधान के साथ 3X constructs.
    4. 0.25% (w / v) 20 मिनट के लिए समाधान अवरुद्ध में ट्राइटन एक्स के साथ झिल्ली Permeabilize.
    5. कुल्ला समाधान अवरुद्ध साथ 3X constructs.
    6. एफ actin के लिए 0.66 μg / एमएल FITC या कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए समाधान को रोकने में rhodamine phalloidin के साथ दाग.
    7. समाधान अवरुद्ध साथ 3x कुल्ला.
    8. 20 मिनट के लिए सेलुलर 0.4 μL / एमएल DAPI में पीबीएस का उपयोग नाभिक दाग.
    9. पीबीएस के साथ 3X कुल्ला.
    10. Epifluorescent या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं कल्पना.
  3. जैल के भीतर कोशिकाओं के प्रसार आमतौर पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध assays (उदाहरण के लिए, कुल डीएनए या जैव रासायनिक सामग्री) का उपयोग मूल्यांकन किया है. PicoGreen आमतौर पर इस्तेमाल किया और संवेदनशील फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग डबल असहाय डीएनए बढ़ाता के लिए है (सिंगर एट अल.) . कोशिकाओं को भी गिना जा सकता है एक प्रारंभिक नियंत्रण दृश्य चरण 2 में वर्णित विधियों का उपयोग कर संख्या के लिए सामान्यीकृत है.
  4. Histological सेक्शनिंग और धुंधला हो जाना भी कोशिकाओं को कल्पना और मैट्रिक्स का गठन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. निर्जलीकरण और 3 डी hydrogels के सेक्शनिंग के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए गिलास स्लाइड पर पार के अनुभागीय स्लाइसें प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
    1. फिक्सेशन और निर्जलीकरण
      1. पीबीएस में 3X नमूना कुल्ला.
      2. 4% paraformaldehyde में 30 मिनट - 5 के लिए ठीक है.
      3. पीबीएस में 3X नमूना कुल्ला.
      4. EtOH में 25 में नमूना सेते ° सी निम्नलिखित EtOH (v / v) पानी में सांद्रता (क्रम में) की प्रत्येक में 1 घंटे के लिए: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (इस बिंदु पर, नमूने रात 25 में संग्रहित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस).
    2. समाशोधन और घुसपैठ
      1. 25 पर 1 घंटा ° सी, 65 में एक घंटे के द्वारा पीछा डिग्री सेल्सियस के लिए 100% Citrisolv स्थानांतरण
      2. एक पेट्री ऐसी है कि नमूने के पार अनुभाग संपर्क में है पकवान में एक धार के साथ नमूने आधे में कट.
      3. 65 में Citrisolv / 1 घंटे के लिए लघु कटौती आयल के 1:1 मिश्रण स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
      4. 1 घंटे के लिए 65 पर 100% आयल लघु कटौती करने के लिए स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
      5. रातोंरात 65 में 100% आयल लघु कटौती करने के लिए स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
      6. 1-2 घंटे के लिए 65 पर 100% आयल लघु कटौती करने के लिए स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
    3. एम्बेड
      1. छील दूर 100% आयल के साथ मोल्ड में स्थिति नमूना.
      2. मोल्ड बिस्तर में मोम की एक छोटी राशि प्लेस, और पार अनुभाग के नीचे का सामना करना पड़ रहा साथ नमूना के दो halves सम्मिलित है.
      3. शीर्ष फिल्टर टुकड़ा लागू
        1. शीर्ष टुकड़ा डूब करने के लिए अतिरिक्त मोम जोड़ें और ~ 10 मिनट के लिए कड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं.
      4. 4 करने के लिए आवेषण डिग्री सेल्सियस फ्रिज कठोर नमूना रातोंरात अनुमति देने के लिए स्थानांतरण.
      5. नमूना अनुभाग हो सकता हैएड अगले दिन, आमतौर पर टुकड़ा प्रति 5-10 सुक्ष्ममापी मोटाई में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microtomes का उपयोग कर. आम तौर पर मोल्ड दूर छील खड़ी सूक्ष्म तक्षणी मंच के खिलाफ मुहिम शुरू की है, और मैन्युअल नियंत्रण अनुभाग मोटाई, और ब्लेड के साथ नमूने की slicer संरेखण सेट किया जाता है.
    4. शाही सेना एक्सट्रैक्शन

      जीन अभिव्यक्ति भी मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है है (उदाहरण के लिए, वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से). 3D hydrogels से शाही सेना निकासी, एक उदाहरण है जो की नीचे दिया जाता है के लिए प्रोटोकॉल बहुत सरल 2 डी मामले से काफी अलग है.
      1. प्रत्येक 3D hydrogel के लिए एक प्रमाणित RNase मुक्त Eppendorf ट्यूब लेबल और 500 μL ® Trizol अभिकर्मक प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें.
      2. एक मूसल (ऊतक चक्की) का उपयोग करने के लिए मैन्युअल hydrogels पीसने तक एक स्पष्ट समाधान प्राप्त है. सुनिश्चित अलग grinders प्रत्येक शर्त के लिए उपयोग किया जाता है.
      3. भंवर प्रत्येक Eppendorf 20 सेकंड के लिए नमूने homogenize.
      4. पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों nucleoprotein परिसरों की पूरी पृथक्करण की अनुमति सेते हैं.
      5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर कूल नमूने
      6. प्रत्येक नमूना और भंवर 200 (प्रति एमएल Trizol) μL क्लोरोफॉर्म जोड़ें.
      7. पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं.
      8. 12,000 XG पर नमूने 4 बजे ° C 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
      9. नई Eppendorf ट्यूबों (interfacial क्षेत्र और कम लाल, phenol के क्लोरोफॉर्म चरण से बचने) जलीय चरण (साफ ऊपर परत) स्थानांतरण. शाही सेना स्पष्ट जलीय चरण में रहता है.
      10. आरएनए अलगाव और भंडारण के लिए आम तकनीक अब इस्तेमाल किया जा सकता है.
      11. के बाद शाही सेना निकासी, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और वास्तविक समय पीसीआर के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट अक्सर कुछ संशोधनों (Elisseff एट अल., Strehin एट अल.) के साथ उपयोग किया जाता है.

प्रतिनिधि परिणाम:

Photopatterned hydrogels और जैल के भीतर कोशिकाओं के encapsulation के दृश्य के प्रतिनिधि के परिणामों के लिए 2-4 आंकड़े (के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में संदर्भित) देखें.

चित्रा 1
चित्रा 1 3 डी encapsulation प्रक्रिया का अवलोकन . आरेख कदम stepwise प्रोटोकॉल अनुभाग में शीर्षक के अनुरूप है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Photopatterned अनुक्रमिक इसके अलावा माइकल प्रकार तत्कालीन कट्टरपंथी polymerization का उपयोग hydrogel. (ए) एक तस्वीर प्रतिक्रियाशील डाई के समावेश के साथ एक आंशिक रूप से Crosslinked hydrogel photopatterning के योजनाबद्ध. (बी) सर्कल या (सी) धारी पारदर्शिता फिल्म मुखौटा hyaluronic एसिड hydrogels नमूनों. Methacrylated rhodamine (MeRho) है कि प्रकाश के संपर्क में थे जेल के क्षेत्रों में ही शामिल है. स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा 3 कोशिकाओं के 3D hydrogels में विज़ुअलाइज़ेशन. स्टेम सेल (क) प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना या (ख) (हरे, Calcein AM) रहते हैं और मृत (लाल, Ethidium homodimer-1) धुंधला 24 घंटे 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल पर एक hyaluronic एसिड एक प्रकाश के माध्यम से Crosslinked hydrogel में encapsulation के बाद मुफ्त कट्टरपंथी तंत्र शुरू की. स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4
चित्रा 4 कोशिकाओं के 3D hydrogels में विज़ुअलाइज़ेशन. hMSCs 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल पर एक hyaluronic एसिड माइकल प्रकार के एक तंत्र के माध्यम से Crosslinked hydrogel में encapsulation के बाद दाग (क) रहते कोशिकाओं (Calcein AM) या (ख) सेलुलर (rhodamine phalloidin) actin और नाभिक (DAPI) पांच दिनों के लिए ( लटकन चिपकने वाला पेप्टाइड्स और bifunctional proteolytically degradable पेप्टाइड crosslinkers का उपयोग). स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल एक सरल और शक्तिशाली करने के लिए एक cytocompatible तरीके से hydrogel scaffolds के भीतर कोशिकाओं encapsulate करने की विधि का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस तरह की तकनीक विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं क्योंकि टर्मिनली विभेदित और स्टेम सेल 2D बनाम 3 डी microenvironments में स्पष्ट रूप से अलग व्यवहार एक्ज़िबिट कर सकते हैं. यहां तक कि चिकित्सीय सामग्री का आरोपण (जैसे, में स्वस्थानी कट्टरपंथी polymerization), सेल encapsulation और व्यवहार्यता और भेदभाव के लिए विश्लेषण शामिल दृष्टिकोण के लिए सामग्री के विकास की प्रक्रिया में मदद कर सकते हैं. वर्णित अनुक्रमिक प्रक्रिया spatially hydrogel वातावरण में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और फलस्वरूप सेलुलर व्यवहार (खेतान एट अल देखें.).

कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण तत्व सभी प्रयोग किया जाता के समाधान के समरूपता है. विशेष रूप से, विशेष देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कोशिकाओं prepolymer समाधान में समान रूप से वितरित कर रहे हैं, और है कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है crosslinker समाधान के अलावा निम्नलिखित विंदुक resuspension द्वारा लिया जाना चाहिए. यह सुनिश्चित करने के लिए न होने कक्षों या जेल संरचना और सूजन में स्थानीय रूपांतरों के clumping नेतृत्व कर सकते हैं.

जबकि प्रोटोकॉल encapsulating कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित यहाँ प्रस्तुत है, यह महत्वपूर्ण है कि यह भी ध्यान रखें कि encapsulation के विश्लेषण प्रोटोकॉल है कि आम तौर पर 2D बोने के लिए लिखा है के लिए कुछ समायोजन की जरूरत हो सकती है. कई उदाहरण visualizing और hydrogels में कोशिकाओं का आकलन करने के लिए सचित्र थे.

Acknowledgments

यह काम एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च एसके और हीथ अनुदान R01EB008722 के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
I2959 Reagent Ciba Specialty Chemicals
.2 M Triethanolamine Buffer Reagent Sigma-Aldrich T0449
PBS Reagent Invitrogen 14040-117 1x, sterile liquid
Live/Dead staining kit Reagent Invitrogen L3224 Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes
Phalloidin-FITC Reagent Sigma-Aldrich P5282
Rhodamine Phalloidin Reagent Invitrogen R415
DAPI Reagent Sigma-Aldrich D9542
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) Reagent Polysciences, Inc. 23591
Bovine Serum Albumin Reagent Sigma-Aldrich A7030
Tween 20 Reagent Sigma-Aldrich P1379
Triton X-100 Reagent Sigma-Aldrich T8787
Citrisolv Reagent Fisher Scientific 22-143975
Micro-cut paraffin Reagent Polysciences, Inc. 24202
Trizol reagent Reagent Invitrogen 15596-026
0.22 μm pore size nylon syringe filters Equipment Fisher Scientific 09-719C
1 mL disposable syringes Equipment BD Biosciences 309602 Cut syringes at consistent height for UV exposure
Wide orifice pipette tips Equipment Sigma-Aldrich P6800
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter Equipment EXFO S1000
254 nm germicidal UV light source Equipment Built into most biological safety cabinets

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References

  1. Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
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Comments

4 Comments

  1. hello.
    can you please tell me how you prepare the samples for viewing under the microscope . (glass + 3D samples+glass) what you use to put between the glasses around your 3D sample.
    i will very appreciate.
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 4, 2011 - 4:35 PM
  2. Hi Dear
    I couldnt watch your visual file, could you please mail it to me.
    thank you so much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 27, 2011 - 12:34 PM
  3. Dear Mr/madam,
    I will be thankful if you email this file to me. The speed of the internet is low and it takes a long time to be uploaded.
    email: mahsa.jamadi@gmail.com
    many thanks

    Reply
    Posted by: mahsa j.
    August 7, 2013 - 3:58 PM
  4. Hi Dear ,
    I am wondering what amazing work you have done .I am very interested in cell encapsulation in hydrogel and have done some work on it. I have tried the live&dead kit to visualize the cells in hydrogel but fluorescence from the hydrogel was too powerful to visualize the cells in it.(calcein AM 2uM,EthD 4uM,20min ).I hope to know how you visualize cell in hydrogel using Live&Dead kit.
    Thank you and I'm looking forward for your reply.

    email:enwy@qq.com

    Reply
    Posted by: yibo g.
    December 18, 2013 - 3:59 AM

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