تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

Biology
 

Summary

نقدم بروتوكولات للتغليف (3D) 3 الأبعاد للخلايا داخل الهلاميات المائية الاصطناعية. ويرد الإجراء التغليف لمدة الأساليب المستخدمة عادة من يشابك (مايكل وبالإضافة إلى ذلك النوع الخفيف شرعت آليات الجذور الحرة) ، فضلا عن عدد من التقنيات لتقييم السلوك مغلفة الخلية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khetan, S., Burdick, J. Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering . J. Vis. Exp. (32), e1590, doi:10.3791/1590 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التغليف 3D من الخلايا داخل الهلاميات المائية يمثل تقنية مهمة على نحو متزايد وشعبية لاستنبات الخلايا ونحو تطوير البنى للهندسة الأنسجة. هذا أفضل ما يحاكي البيئة مراقبة الخلايا في الجسم الحي ، بالمقارنة مع زراعة الأنسجة القياسية ، ويرجع ذلك إلى خصائص مثل النسيج والبيئة 3D. البوليمرية الهلاميات المائية الاصطناعية وشبكات المياه تورم التي يمكن أن تكون مصممة لتكون مستقرة أو للحط من خلال التحلل المائي أو التحلل البروتيني كما هو المودعة من قبل خلايا أنسجة جديدة مغلفة. وقد تم استكشاف مجموعة واسعة من البوليمرات لهذه التطبيقات ، مثل بولي (جلايكول الإثيلين) وحامض الهيالورونيك. الأكثر شيوعا ، هو البوليمر functionalized التفاعل مع مجموعات مثل methacrylates أو acrylates قادرة على يشابك تمر من خلال آليات مختلفة. في العقد الماضي ، أحرز تقدم كبير في مجال الهندسة microenvironments هذه -- على سبيل المثال ، عن طريق دمج والتساهمية البدني أو قلادة من الاشارات البيوكيميائية -- لتحسين سلامة والنمط الظاهري المباشر الخلوية ، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية مغلفة (Burdick وآخرون).

وقد تم تحسين الأساليب التالية لتغليف 3D من الخلايا في مختبراتنا وغيرها من لتعظيم cytocompatibility وتقليل عدد خطوات التجهيز هيدروجيل. في البروتوكولات التالية (انظر الشكل رقم 1 لتوضيح الإجراء) ، فمن المفترض أن البوليمرات functionalized قادرة على يشابك تمر بالفعل في متناول اليد ، ويمكن الاطلاع على آراء ممتازة للكيمياء البوليمرات على النحو المطبق في مجال هندسة الأنسجة في مكان آخر (Burdick وآخرون) ، وهذه الأساليب متوافقة مع مجموعة واسعة من أنواع البوليمر. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى مايكل من نوع (انظر Lutolf وآخرون) وخفيفة بدأت الجذور الحرة (انظر Elisseeff وآخرون.) ركزت على آليات هنا لا تشكل سوى جزء صغير من التقنيات يشابك عنها. يشابك مختلطة واسطة ، والتي استهلكت لأول مرة جزء من رد الفعل من قبل الجماعات يشابك بالإضافة إلى وجود آلية تليها الراديكالية ، هو نموذج آخر استخداما وقوية لتوجيه النمط الظاهري للخلايا مغلفة (Khetan وآخرون ، وآخرون ساليناس).

Protocol

أ إعداد المواد والتعقيم

  1. مواد التغليف قبل إعداد وتحضير 0.5 ٪ بالوزن حل photoinitiator Irgacure 2959 (I2959) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، عن طريق مزج وتفرخ لعدة أيام عند 37 درجة مئوية. يمكن أن يكون الحل حقنة ثم تصفيتها للتعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها على المدى البعيد.
  2. استنادا إلى تركيبة المطلوب من المواد الهلامية إلى إعادة تصنيعه ، وحساب (باستخدام برنامج جدول بيانات مثل Microsoft Excel) وزن البوليمر وcrosslinker الحاجة. يجب أن يتم حله لأنه يجب أن وزن معين من البوليمر في حجم ما مجموعه محددة لتحقيق التركيز المطلوب في الهلاميات المائية ، وأجزاء crosslinker حل البوليمر من حجم مجموع هلام أيضا أن تحدد باستخدام البيانات. وينبغي بذل حسابات مماثلة وجدت شاردات قلادة (على سبيل المثال ، وهي لاصقة أو RGD YGSR تحتوي oligopeptide) هي التي ستدرج قبل يشابك.
  3. وزن الكمية المطلوبة من البوليمر وcrosslinker ومكان في أنابيب إيبندورف. ضبط جداول حسابية وفقا للوزن الفعلي من البوليمر التي حصل عليها. (ملاحظة : يمكن تغيير حجم للتعويض عن الكتلة الفعلية من البوليمر وحصلت crosslinker).
  4. إعداد قوالب الجل باستخدام شفرة حلاقة لقطع قمم الخروج من المحاقن المعقمة ملفوفة بشكل فردي مل 1 المتاح. يتم ضمان وجود قطع مسطحة لقوالب لاستخدامها في المواد الهلامية photopatterned.
  5. وضع قوالب الحقن والأنابيب إيبندورف (مع مباراة مفتوحة) وأية مواد أخرى ضرورية تحت مصدر ضوء مبيد للجراثيم (بني عادة في خزانات السلامة البيولوجية) وتعقيم لمدة 30 دقيقة.

باء خلية التحضير

  1. بعد التعقيم ، إضافة مناسبة حجم العازلة العقيمة (لكل جدول الحسابات ، في حين أن اختيار العازلة يمكن أن تختلف ، في برنامج تلفزيوني ، وتستخدم عادة العازلة قاعدة ضعيفة مثل ثلاثي إلإيثانولامين مجانا يشابك الراديكالية ومايكل نوع ، على التوالي) إلى البوليمر وإيبندورف (اختياريا) شاردة قلادة ليتم تضمينها (على سبيل المثال ، لاصق ببتيد) ، ودوامة لإذابة (إذا vortexing خارج التفاف هود عقيمة مع parafilm إيبندورف).
  2. إضافة الحجم المناسب للقلادة حل شاردة في حل البوليمر والتفاف مع ختم parafilm. دوامة لفترة وجيزة واحتضان عند 37 درجة مئوية للرد (إذا كان ذلك ممكنا ، فوق لوحة تحريك الدوار) أثناء إعداد الخلية. وهذا ينطوي على رد فعل من ثيول على الببتيد (عبر مجموعة السيستين) إلى اكريليت أو ميتاكريليت بحيث يتم تضمين الببتيد كمجموعة قلادة في هيدروجيل النهائي.
  3. ويعرض للتريبسين عدد الخلايا إلى أجزاء منفصلة وتحتوي على العدد المناسب لكل مجموعة من المواد الهلامية. على سبيل المثال ، مجموعة من ثلاثة 50 ميكرولتر المواد الهلامية في الكثافة من 10 مليون خلية / منفصلة مل 1500000 الخلايا المخروطية في أنبوب an الفردية. فمن المستحسن أن تكون مستعدة أكثر من 4 في مجموعة المواد الهلامية الفردية بسبب توقيت تهليم (ملاحظة : إذا كان تجميع مجموعات متعددة من المواد الهلامية ، ويمكن إعداد إيبندورف واحد يحتوي على كمية كافية من محلول البوليمر لجميع مجموعات).
  4. الطرد المركزي الخلايا.
  5. في حين أن الخلايا هي الغزل أسفل
    1. بدأ الضوء يشابك الجذور الحرة : إضافة 0.5 ٪ بالوزن I2959 الحل في حل البوليمر يساوي 10 ٪ من حجم مجموع مجموعة هلام (للتركيز المبادر النهائي لل٪ بالوزن 0.05).
    2. مايكل من نوع (إضافة) يشابك : إضافة إلى crosslinker العازلة للوصول الى الحل المناسب التركيز.
    3. ليشابك متسلسل : هذه المواد الهلامية دمج هذين النوعين من يشابك وتتطلب كل من الخطوات السابقة.

جيم تشكيل هيدروجيل

  1. طاف نضح من جزء الخلية بالطرد المركزي. انتظر السائل ليستقر بعد التطلع الأولي وإعادة نضح إلى إزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان دون الإخلال بيليه الخلية.
  2. Resuspend بيليه في الخلية التي تحتوي على حل البوليمر حتى يتم توزيعها بالتساوي الخلايا. تقليل تكوين فقاعة من قبل pipetting ببطء الحل صعودا وهبوطا (حوالي 10 دورات ينبغي أن تكون كافية لتوزيع الخلايا).
  3. يشابك الهلاميات المائية
    1. بدأ الضوء يشابك الجذور الحرة : قسامة حجم المناسبة في قوالب طرف الحقنة. فضح المحاقن لضوء الأشعة فوق البنفسجية ليشابك الراديكالية (مثل التعرض 10 دقيقة ل365 نانومتر ، 4 ضوء الأشعة فوق البنفسجية mW/cm2 شائع للبوليمرات اكريليت functionalized). يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة للحد من خلية تسوية قبل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
    2. مايكل من نوع (إضافة) يشابك : استخدام غيض ماصة فوهة واسعة ، إضافة إلى حجم مناسب من حل crosslinker في حل البوليمر / خلية ، تعيين ماصة لحجم هلام الفردية المطلوب ، ماصة الحل صعودا وهبوطا لالتجانس ، وقسامة في قوالب طرف الحقنة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل سريع لضمان توزيع عادل للخلايا. تسمح 10-30 دقيقة (اعتمادا على النظام الفردي) في حضانة هود ثقافة يشابك.
    3. يشابك متسلسل : وهذا ينطوي على رد فعل من نوع بالإضافة إلى مايكل أولا ثم التعرض للضوء ليشابك الثانية. وينبغي أن رد فعل جزء فقط من خلال النظرية crosslinks يشابك أولا ثم ينبغي أن تطبق قناع المعقمة مباشرة إلى سطح هلام قبل التعرض للضوء باستخدام ملاقط معقمة. ويمكن أيضا صبغة functionalized (على سبيل المثال ، رودامين methacrylated (MeRho) في النهائي في تركيز جل من 20 نانومتر) يمكن ان تضاف الى حل الأولية لتصور الزخرفة ، لأنها ستضم بشكل تفضيلي في مناطق crosslinked جذريا من هلام (الشكل 2 ).

دال خلية ثقافة والتحليل

  1. يشابك التالية ، والهلام يغرقون في بئر من نسيج لوحة تحتوي على وسائل الإعلام لثقافة الحضانة والتحليل (أنظر الخطوات التالية).
  2. ويمكن تصور أن تكون الخلايا لاستخدام المجهر الضوئي مورفولوجيا (الشكل 3 ؛ عادة ، الهلاميات المائية توليفها وشفافية) ، وقابلية استخدام الفلورسنت عدة تلطيخ يعيش / ميت (الشكلان 3 و 4). ويمكن للتلوين أكتين الخليوي (على سبيل المثال ، أو رودامين فلوريسئين المسمى phalloidin) والنوى (على سبيل المثال ، 4' - 6 - Diamidino - 2 - phenylindole (دابي)) أن يقوم به التثبيت وإجراءات موحدة permeabilization (الشكل 4) مع الإجراء التالي.
    1. شطف يبني 3X لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    2. إصلاح المواد الهلامية التي حضانة في الفورمالدهايد مل 1 4 ٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. شطف يبني 3X بمحلول يحتوي على حجب 3 ٪ (W / V) BSA و 0.5 ٪ (W / V) توين في برنامج تلفزيوني.
    4. Permeabilize الغشاء مع 0.25 ٪ (W / V) X تريتون في عرقلة الحل لمدة 20 دقيقة.
    5. شطف يبني 3X مع عرقلة الحل.
    6. وصمة عار للأكتين - F مع 0.66 ميكروغرام / مل أو FITC phalloidin رودامين في عرقلة الحل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
    7. شطف 3X مع عرقلة الحل.
    8. وصمة عار النوى الخلوية باستخدام 0.4 ميكروليتر / مل دابي في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
    9. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني.
    10. تصور الخلايا باستخدام المجهر epifluorescent أو مبائر.
  3. عادة يتم تقييم انتشار الخلايا داخل الجل باستخدام المقايسات المتوفرة تجاريا (مثل الحمض النووي أو المحتوى مجموع البيوكيميائية). PicoGreen هي المستخدمة ، وأحماض نووية حساسة لقياس الفلورسنت صمة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سنجر وآخرون). ويمكن أيضا أن تحسب الخلايا وتطبيع لعدد الرقابة الأولية باستخدام أساليب التصور الموصوفة في الخطوة 2.
  4. ويمكن أيضا sectioning النسيجية وتلطيخ يمكن استخدامها لتصور وشكلوا خلايا المصفوفة. ويمكن استخدام بروتوكول التالية للجفاف وsectioning من الهلاميات المائية 3D للحصول على شرائح مستعرضة على الشرائح الزجاجية :
    1. التثبيت والجفاف
      1. شطف العينة 3X في برنامج تلفزيوني.
      2. الإصلاح لمدة 5 -- 30 دقيقة في بارافورمالدهيد 4 ٪.
      3. شطف العينة 3X في برنامج تلفزيوني.
      4. احتضان عينة في EtOH عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في كل من EtOH التالية (V / V) تركيزات في الماء (بالترتيب) : 50 ٪ ، 70 ٪ ، 95 ٪ ، 95 ٪ و 100 ٪ (عند هذه النقطة ، والعينات ويمكن تخزين بين عشية وضحاها في درجة حرارة 25 درجة مئوية).
    2. المقاصة والتسلل
      1. نقل إلى Citrisolv 100 ٪ لمدة 1 ساعة على 25 درجة مئوية ، تليها ساعة واحدة عند 65 درجة مئوية.
      2. قطع العينات في النصف بشفرة حلاقة في طبق بتري بحيث يتم كشفها المقطع العرضي للعينة.
      3. نقل إلى 1:1 خليط من Citrisolv / برافين الصغرى ، قطع لمدة 1 ساعة على 65 درجة مئوية.
      4. نقل إلى برافين مايكرو قطع 100 ٪ لمدة 1 ساعة على 65 درجة مئوية.
      5. نقل إلى برافين مايكرو قطع 100 ٪ بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
      6. نقل إلى برافين مايكرو قطع 100 ٪ لمدة 1-2 ساعات عند 65 درجة مئوية.
    3. التضمين
      1. عينة الموقف في قشر بعيدا العفن مع البارافين 100 ٪.
      2. ضع كمية صغيرة من الشمع في السرير العفن ، وإدراج نصفي من العينة مع المقطع العرضي أسفل.
      3. تطبيق قطعة تصفية الأعلى
        1. إضافة الشمع إضافية لغمر قطعة الأعلى والسماح لتتصلب لمدة 10 دقائق ~.
      4. نقل إدراج إلى 4 درجات مئوية البراد للسماح العينة لتتصلب بين عشية وضحاها.
      5. قد تكون العينة القسمإد في اليوم التالي ، وعادة في 50-10 ميكرومتر سمك في شريحة باستخدام microtomes متاحة تجاريا. عادة ما يتم تركيب القالب قشر بعيدا عموديا ضد مشراح المرحلة ، وتستخدم عناصر التحكم اليدوي لتعيين سمك الباب ، وتقطيع اللحم والمواءمة مع عينة من النصل.
    4. استخراج الحمض النووي الريبي

      ويمكن أيضا التعبير الجيني يتم تقييمها كميا (مثلا ، عبر في الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)). بروتوكول لاستخراج الحمض النووي الريبي من الهلاميات المائية 3D ، على سبيل المثال من الذي يرد أدناه ، هي مختلفة تماما عن الحالة 2D أبسط من ذلك بكثير.
      1. تسمية ريبونوكلياز مصدقة أنبوب إيبندورف مجانية لكل هيدروجيل 3D وإضافة 500 Trizol ميكرولتر ® الكاشف لكل أنبوب.
      2. استخدام مدقة (طاحونة الأنسجة) لطحن يدويا الهلاميات المائية حتى يتم الحصول على حل واضح. وتستخدم المطاحن ضمان مختلفة لكل حالة.
      3. دوامة كل إيبندورف لمدة 20 ثانية لتجانس العينات.
      4. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق للسماح التفكك الكامل للمجمعات البروتين النووي.
      5. تبريد العينات في الثلج لمدة 20 دقيقة
      6. إضافة 200 ميكرولتر (لكل مليلتر Trizol) كلوروفورم لكل عينة والدوامة.
      7. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
      8. أجهزة الطرد المركزي في عينات XG 12000 في 4 لمدة 15 دقيقة درجة مئوية.
      9. نقل المرحلة المائية (الطبقة العليا واضحة) لأنابيب جديدة إيبندورف (تجنب المنطقة البينية وانخفاض الحمراء ، المرحلة الفينول كلوروفورم). الحمض النووي الريبي لا يزال في المرحلة مائي واضحة.
      10. ويمكن الآن التقنيات الشائعة لعزل الحمض النووي الريبي وتخزينها يمكن استخدامها.
      11. وغالبا ما تستخدم التالية استخراج الحمض النووي الريبي ، ومجموعات المتاحة تجاريا لالمنتسخة العكسية وPCR الوقت الحقيقي مع بعض التعديلات (Elisseff آخرون ، Strehin وآخرون).

ممثل النتائج :

انظر الشكلين 2-4 (المشار إليه أعلاه في بروتوكولات) من أجل تحقيق النتائج ممثلة تصور photopatterned الهلاميات المائية والتغليف من المواد الهلامية داخل الخلايا.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة الداخلي التغليف 3D. الخطوات المخطط تتوافق مع عناوين القسم في البروتوكولات متدرج.

الشكل 2
هيدروجيل Photopatterned الرقم 2. البلمرة المتسلسل باستخدام إضافة مايكل جذرية من نوع ذلك الحين. (أ) من photopatterning تخطيطي لهيدروجيل crosslinked جزئيا مع إدراج صورة صبغ رد الفعل. (B) أو الدوار (C) شريط فيلم قناع الشفافية نمط الهلاميات المائية حمض الهيالورونيك. أدرج رودامين Methacrylated (MeRho) فقط في مناطق الجل التي تعرضت للضوء. أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. التصور من الخلايا في الهلاميات المائية 3D. تصور الخلايا الجذعية من خلال (أ) المجهر الضوئي أو (ب) يعيش (أخضر ، Calcein AM) والموت (أحمر ، إيثيديوم homodimer - 1) تلطيخ 24 ساعة التالية التغليف بمبلغ 1 مليون خلية / مليلتر في هيدروجيل حمض الهيالورونيك crosslinked من خلال الضوء بدأت آلية جذرية حرة. أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر.

الشكل 4
الشكل 4. التصور من الخلايا في الهلاميات المائية 3D. hMSCs الملون ل(أ) الخلايا الحية (Calcein AM) أو (ب) الخلوي أكتين (رودامين phalloidin) ونوى (دابي) الأيام الخمسة التالية التغليف بمبلغ 1 مليون خلية / مليلتر في هيدروجيل حمض الهيالورونيك crosslinked من خلال آلية من نوع مايكل ( استخدام الببتيدات لاصقة وقلادة bifunctional crosslinkers الببتيد تحلل proteolytically). أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر.

Discussion

البروتوكولات المذكورة يمثل طريقة بسيطة وقوية لتغليف الخلايا داخل السقالات هيدروجيل بطريقة cytocompatible. مثل هذه التقنيات أهمية خاصة منذ متباينة عضال والخلايا الجذعية يمكن أن يحمل سلوك مختلف بشكل ملحوظ في مقابل microenvironments 2D 3D. يمكن حتى للنهج العلاجية التي تنطوي على غرس المواد (على سبيل المثال ، في الموقع البلمرة الراديكالية) ، التغليف الخلية وتحليلها من أجل البقاء وتمايز المساعدة في عملية التنمية المادية. يمكن استخدامها في عملية وصفها متتابعة لمعالجة البيئة هيدروجيل مكانيا ، وبالتالي السلوك الخليوي (انظر Khetan وآخرون).

عموما ، فإن أهم عنصر من البروتوكولات المذكورة هو تجانس جميع الحلول المستخدمة. على وجه الخصوص ، ينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان موزعة بالتساوي الخلايا في حل prepolymer ، وهذا هو الحل تمتزج جيدا قبل إعادة تعليق ماصة التالية إضافة الحل crosslinker. يمكن أن فشله في ضمان هذا يؤدي الى تراكمها من الخلايا أو الاختلافات المحلية في الهيكل هلام والتورم.

بينما البروتوكولات المعروضة هنا تركز أساسا على إجراء لتغليف الخلايا ، ومن المهم أن نلاحظ أيضا أن التغليف قد تتطلب بعض التعديل لتحليل البروتوكولات التي تتم كتابتها عادة لبذر 2D. وبرز العديد من الأمثلة عن تصور وتقييم الخلايا في الهلاميات المائية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للزمالة أبحاث العلوم العليا لSK والمعاهد الوطنية للمنح R01EB008722 هيث.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
I2959 Reagent Ciba Specialty Chemicals
.2 M Triethanolamine Buffer Reagent Sigma-Aldrich T0449
PBS Reagent Invitrogen 14040-117 1x, sterile liquid
Live/Dead staining kit Reagent Invitrogen L3224 Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes
Phalloidin-FITC Reagent Sigma-Aldrich P5282
Rhodamine Phalloidin Reagent Invitrogen R415
DAPI Reagent Sigma-Aldrich D9542
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) Reagent Polysciences, Inc. 23591
Bovine Serum Albumin Reagent Sigma-Aldrich A7030
Tween 20 Reagent Sigma-Aldrich P1379
Triton X-100 Reagent Sigma-Aldrich T8787
Citrisolv Reagent Fisher Scientific 22-143975
Micro-cut paraffin Reagent Polysciences, Inc. 24202
Trizol reagent Reagent Invitrogen 15596-026
0.22 μm pore size nylon syringe filters Equipment Fisher Scientific 09-719C
1 mL disposable syringes Equipment BD Biosciences 309602 Cut syringes at consistent height for UV exposure
Wide orifice pipette tips Equipment Sigma-Aldrich P6800
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter Equipment EXFO S1000
254 nm germicidal UV light source Equipment Built into most biological safety cabinets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
  2. Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Cell-Responsive Synthetic Hydrogels. Adv Mater. 15, 888-892 (2003).
  3. Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. Cellular Photoencapsulation in Hydrogels. Culture of Cells for Tissue Engineering. (2006).
  4. Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
  5. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
  6. Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
  7. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells. Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).
  8. Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
  9. Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels. Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).

Comments

4 Comments

  1. hello.
    can you please tell me how you prepare the samples for viewing under the microscope . (glass + 3D samples+glass) what you use to put between the glasses around your 3D sample.
    i will very appreciate.
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 4, 2011 - 4:35 PM
  2. Hi Dear
    I couldnt watch your visual file, could you please mail it to me.
    thank you so much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 27, 2011 - 12:34 PM
  3. Dear Mr/madam,
    I will be thankful if you email this file to me. The speed of the internet is low and it takes a long time to be uploaded.
    email: mahsa.jamadi@gmail.com
    many thanks

    Reply
    Posted by: mahsa j.
    August 7, 2013 - 3:58 PM
  4. Hi Dear ,
    I am wondering what amazing work you have done .I am very interested in cell encapsulation in hydrogel and have done some work on it. I have tried the live&dead kit to visualize the cells in hydrogel but fluorescence from the hydrogel was too powerful to visualize the cells in it.(calcein AM 2uM,EthD 4uM,20min ).I hope to know how you visualize cell in hydrogel using Live&Dead kit.
    Thank you and I'm looking forward for your reply.

    email:enwy@qq.com

    Reply
    Posted by: yibo g.
    December 18, 2013 - 3:59 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics