عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم طريقة لعزل وتنقية

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Iyer, E. P., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting. J. Vis. Exp. (34), e1599, doi:10.3791/1599 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

و

Protocol

تعليقات عامة على الفرز المغناطيسي حبة من الخلايا العصبية المحيطية ذبابة الفاكهة (توقيت الاجمالي لاستكمال البروتوكول : 2،5-3 ساعات)

إجراءات يجب مراعاتها المختبر القياسية للحفاظ على بيئة نظيفة ريبونوكلياز ، مجانا في جميع الأوقات لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.

عندما يتم تشريح إهاب يرقات ذبابة الفاكهة ووضع في زنزانة تفارق العازلة ، والخلايا العصبية المحيطية هي واحدة من خلايا الماضي لفصل من إهاب. لقد استغل هذه الخاصية ونحن صمم هذا البروتوكول إلى إزالة معظم الخلايا غير محدد من إهاب مثل العضلات والدهون قبل عزل الخلايا العصبية دا.

مع الممارسة ، ويمكن للبروتوكول كامل بنجاح في غضون ما يقرب من 2.5 ساعة. ويجب الانتهاء من إعداد حبات مغلفة الأضداد يبدأ قبل التجربة.

1. إعداد الخرز المغناطيسي للخلايا التجليد :

يجب إكمال هذه الخطوة قبل بدء التجربة. يمكن تحضير حبات إعدادها وتخزينها في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.

  1. تغسل حبات 100 ميكرولتر من Dynabeads Streptavidin M - 280 المغلفة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني عن طريق إعادة التعليق في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني جديد والتكوير في حقل مغناطيسي قوي في كل مرة.
  2. resuspend أخيرا حبات مباشرة في 100 ميكرولتر من مخفف biotinylated مكافحة الفئران الفأر CD8a الأضداد (تركيز الضد هو 100 ميكروغرام / مل).
  3. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة على الجليد مع vortexing خفيفة أحيانا لمنع الترسيب. [1 يمكن ميكرولتر من Dynabeads M - 280 ميكروغرام من 0،05-0،10 ربط الأضداد biotinylated].
  4. يغسل الخليط حبة الضد ثلاث مرات كما هو موضح في الخطوة 1.1 لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. والمغلفة الآن الخرز المغناطيسي مع الضد وعلى استعداد لاستخدامها. تخزين خليط حبة الأضداد في 100 ميكرولتر من 1X PBS 4 حتى في استخدام درجة مئوية.

2. اختيار والغسل اليرقات : (10-15 دقيقة)

  1. التخزين المؤقت اختيار سن 30-50 المتطابقة اليرقات طور مرحلي الثالث ووضعها في أنبوب microfuge 1.6ml مع 1-1،2 مل من الفوسفات 1X المالحة (PBS). (3-5 دقائق)
  2. إغلاق الأنبوب ، وذلك في دوامة إعداد الحد الأقصى ثلاث مرات في كل ثانية : 1.
  3. تستخدم لاطلاق النار مصقول ماصة باستير طاف تجاهل تماما. تكرار غسل (2.1) ، والدوامة (2.2) الخطوات 3-4 مرات حتى طاف هو واضح بشكل واضح من أي جزيئات الغذاء والحطام.
  4. تكرار الغسيل لفترة وجيزة مع 1 مل من الايثانول 70 ٪ وتجاهل طاف.
  5. غسل اليرقات مرتين مع 1 مل من ddH2O وتجاهل طاف.
  6. كرر بإيجاز يغسل مرة أخرى مع 1 مل من ريبونوكلياز بعيدا ورفض طاف.
  7. غسل يرقات ثلاث مرات في 1 مل من ddH2O لضمان الإزالة التامة للريبونوكلياز بعيدا.

3. تشريح : (10-12 دقيقة)

  1. مكان 10-12 اليرقات على وسط اللوحة مغلفة Sylgard بيتري 35mm. وضعها بعيدا قليلا عن بعضها البعض. [خطوة حاسمة : تخلصي من أي اليرقات التي لا يبدو أن في هذه المرحلة التنموية المناسبة]
  2. قطع مفتوحة الطرف الأمامي لليرقات باستخدام مقص تشريح غرامة لجميع اليرقات.
  3. باستخدام زوج من مملة ملقط دومون رقم 5 عكس اليرقات من الداخل إلى الخارج. إدراج أحد forcep اليرقات داخل بشرة كل الطريق إلى النهاية الخلفية. قرصة نصائح من ملقط معا للاستيلاء على نهاية الخلفي من إهاب (الشكل 1A) (محاولة الضغط على بشرة أسفل على سطح Sylgard لجعله أسهل). باستخدام الملقط الزوج الثاني ، دفع إهاب اليرقات الداخل الى الخارج. [خطوة حاسمة : حاول ممارسة هذا الأسلوب عدة مرات قبل محاولة تجربة العزلة الخلية. محاولة الحصول على يرقات مقلوب تماما ، لضمان أن تتعرض كل الأنسجة اللينة في حل سهل لتفارق.]
  4. بعد تشريح اليرقات 3-4 ، ونقل على الفور إلى برنامج تلفزيوني جديد الثلج الباردة ، (وضع أنبوب على الجليد) في أنبوب 1.6 مل microfuge.
  5. كرر الخطوات من 3،1-3،4 حتى يتم جمع كل اليرقات المطلوبة (30-40 اليرقات في هذا البروتوكول). [خطوة حاسمة : توقع خسارة 10-20 ٪ خلال تشريح والتفكك ، وفقا لخطة]

4. إزالة الخلايا غير محددة ملتصقة فضفاضة : (2-3 دقائق)

[هذه الخطوة المساعدات تطهير الأنسجة غير محددة ملتصقة فضفاضة مثل الهيئات الدهون والجهاز العصبي المركزي.]

  1. اتخاذ microfuge 1.6 مل أنبوب يحتوي على البشرة مقلوب اليرقات واستبدالها طاف مع ما يقرب من 700-800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة العذبة.
  2. نبض دوامة أنبوب microfuge 5 مرات (3 ثوان لكل نبضة) بأقصى سرعة.
  3. تجاهل طاف واستبدالها مع ما يقرب من 700-800 ميكرولتر الطازجة PBS الجليد الباردة.
  4. كرر الخطوات من 4.2 و 4.3 ثلاث مرات.
  5. الدقةuspend البشره اليرقات في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني جديد الثلج الباردة ،

5. عدم الربط بين الأنسجة في تعليق خلية واحدة : (18-20 دقيقة)

[خطوة حاسمة : أكثر من التفكك ، قد يتسبب في فقدان علامة سطح الخلية مما يؤدي إلى إنتاجية الخلية الفقراء وذوي الصلاحية الخلية. يمكن للأنسجة اليرقات يمكن أن ينفصل إما تفارق الميكانيكية (صوتنة ، douncing) ، تفارق الأنزيمية (التربسين ، كولاجيناز الخ) ، أو مزيج من الاثنين معا. حيث أن هذه اليرقات الأنسجة يصعب فصل ، وجدنا أن مزيج من الاثنين معا تفارق الميكانيكية والأنزيمية حققت أفضل النتائج.]

  1. إضافة 1.5 ميكرولتر من 1X Liberase Blendzyme 3 (W 28 وحدات nsch / فيال) إلى إهاب اليرقات معلقة في ميكرولتر من 400 برنامج تلفزيوني.
  2. دوامة الحل 2-3 مرات عن 1 في كل ثانية في إعداد الحد الأقصى (وهذا يجب إزالة الخلايا الملتصقة فضفاضة من إهاب في الحل).
  3. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. [خطوة حاسمة : تمتد فترة الحضانة تؤثر بشكل كبير في الفرز النهائي الخلية الكفاءة. ينبغي أن فترة حضانة أوصت يكون كافيا لتخفيف الأنسجة. لا تتجاوز 15 دقيقة.]
  4. نبض دوامة أنبوب 2-30 مرات في ضبط الحد الأقصى لمدة 2 ثانية لكل نبضة بأقصى سرعة. ينبغي لهذه النشرات في العضلات والأنسجة الأخرى في الحل. فحص عينة صغيرة من المحلول تحت المجهر الفلورسنت ستيريو في كل خطوة. (مع خبرة ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تحديد مستوى تفارق بملاحظة الأنبوب microfuge مباشرة تحت المجهر مضان تمكين ستيريو)
  5. غسل البشرة اليرقات 2-3 مرات مع الطازجة PBS الجليد الباردة ، ولهم في النهاية resuspend 500 ميكرولتر من جديد ، والجليد الباردة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني BSA 1 ٪.
  6. لتجنب إهاب اليرقات العالقة إلى السطح الزجاجي لطاحونة 2 مل Kontes الأنسجة وإزالة مدقة كبيرة ، قبل معطف طاحونة الأنسجة ومدقة مع جيش صرب البوسنة 1 ٪ في حل برنامج تلفزيوني وبعد شطف قصيرة رفض حل جيش صرب البوسنة. في وقت لاحق ، وذلك باستخدام ماصة باستير النار مصقول ، ونقل البشرة من الخطوة 5.5 إلى طاحونة BSA الأنسجة المغلفة. [خطوة حاسمة : قبل تبريد الأنسجة طاحونة / مدقة بوضعه على الجليد لبضع دقائق لمنع تلف الخلايا / تحلل].
  7. Dounce النسيج مع ضربات بطيئة وثابتة ، وتجنب مزبد (حوالي 20-30 السكتات الدماغية). [خطوة حاسمة : Dounce ببطء ولكن بثبات ، وإلا فإن الخلايا قد ليز]
  8. لتقييم مستويات تفارق الخلية ، امسح الجدار الخارجي للطاحونة الأنسجة بمنديل Kimwipe نظيفة ، وتفتيشها تحت المجهر الفلورسنت ستيريو. ينبغي أن يكون فصل الخلايا العصبية من بشرة ، ويمكن رؤيته في الحل. إذا وجدت أن هذا سيكون صعبا ، بدلا من ماصة عينة صغيرة من الحل ، وذلك تحت مراقبة الفلورسنت ستيريو المجهر. مؤشرا جيدا تفارق الخلية هو عدم وجود الخلايا العصبية من إهاب اليرقات. ومع ذلك ، اذا كان احد لا يزال يلاحظ الخلايا العصبية التي تعلق على بشرة ، أو تلاحظ الخلايا تنفصل بشكل غير كامل ، dounce مزيد من الخلايا حتى تحقيق تعليق خلية واحدة.
  9. ضاقت متمزج الحل 5 مرات مع ماصة باستير النار مصقول لحوالي 50 ٪ من قطر الحافة القياسية ، تليها 10 مرات مع ماصة باستير النار مصقول ضاقت إلى ما يقرب من 25 ٪ من قطر الحافة القياسية. [خطوة حاسمة : سحن القسرية ، قد يؤدي إلى تلف الخلايا. رصد خلايا بين الخطوات ، وضبط الإجراءات وفقا لذلك].
  10. تصفية الحل عن طريق تصفية الخلية 30 ميكرومتر وجمع الرشاحة الخلية في أنبوب 1.6 مل microfuge. ينبغي أن حل يؤدي تتكون من خلية واحدة والتعليق على استعداد الآن للفرز خلية المغناطيسي.

6. فرز المغناطيسي خلية حبة : (45 -- 75 دقيقة ، اعتمادا على فترة حضانة الضد)

  1. إضافة 15 ميكرولتر الضد من الخرز المغناطيسي المغلفة إلى 500 ميكرولتر من تعليق خلية (الخطوة 5.10). ويمكن تخزين الضد مترافق المتبقية حتى حبات مغناطيسية اللازمة لخلية العزلة اللاحقة.
  2. احتضان خلايا الجسم المضاد مع الخرز المغناطيسي المغلفة لل30-60 دقيقة على الجليد مع خلط أحيانا غير المباشر. [خطوة حاسمة : قد الحضانة في درجة حرارة أعلى ، أو وقتا أطول في النتيجة ملزمة الأضداد غير محدد.]
  3. وضع أنبوب microfuge في حقل مغناطيسي قوي لمدة 2 دقيقة. وجميع الخلايا المحددة بشكل إيجابي مع حبات منفصلة غير منضم الى جانب الأنبوب.
  4. ماصة طاف ببطء ، والتأكد من عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
  5. غسل خلايا 3-4 مرات في برنامج تلفزيوني جديد الثلج الباردة ، لإزالة أي المتبقية غير محددة الخلايا.
  6. Resuspend الخلايا في 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني جديد الثلج الباردة.
  7. لنقاء تقريب والعائد من الخلايا ، ماصة 5 ميكرولتر من خلية SUSPension على السطح المصقول من عدادة الكريات وحساب كافة الخلايا المرئية الفلورية تحت المجهر الفلورسنت ستيريو. الاختيار أيضا على كمية من الخلايا غير الفلورسنت وأية علامات من الشوائب. وعادة ما تكون العينة عالي التخصيب لخلايا الفلورسنت.

7. عزل خلايا الحمض النووي الريبي من حبة المغناطيسي الترتيب : (60 -- 75 دقيقة)

  1. بعد العد ، بيليه الخلايا في حقل مغناطيسي ، وتجاهل طاف إضافة 20 ميكرولتر من استخراج العازلة من ™ PicoPure كيت عزل الحمض النووي الريبي (الأجهزة الجزيئية). اعتمادا على عدد الخلايا واحد قد تحتاج إلى إضافة زيادة حجم استخراج العازلة.
  2. دوامة أنبوب بأقصى سرعة ممكنة لتمكين اختلاط مع بيليه الخلية العازلة الاستخراج.
  3. احتضان الأنبوب في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. لضمان إزالة الخرز المغناطيسي قبل تنقية عمود من الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 7.5) ، وطرد لفترة وجيزة في الأنبوب ز (خ) 2000 لمدة 2 دقيقة لتكوير حبات المغناطيسي. ثم يتم وضع الأنبوب في حقل مغناطيسي قوي للاحتفاظ بيليه ، وطاف لنقل أنبوب microfuge جديدة.
  5. استخراج وتنقية العمود RNA وفقا لتعليمات الصانع استخراج الحمض النووي الريبي PicoPure عدة ل. الدناز العلاج هو اختياري ، ويمكن تنفيذها على عمود خلال تنقية الحمض النووي الريبي وفقا لمتطلبات التحليل. أخيرا ، وأزل الحمض النووي الريبي ملزمة إجمالي في حجم صغير (11-30 ميكرولتر) من شطف العازلة وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. إذا رغبت في أن تكون قد استخدمت قسامة 1 ميكرولتر لتقييم جودة مجموع الحمض النووي الريبي على Bioanalyzer 2100 (اجيلنت تكنولوجيز ، وشركة).

ممثل النتائج :

وقد استخدم الفرز حبة المغناطيسي لعزل الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة (الشكل 1). تم العثور على الحمض النووي الريبي تنقيته من هذه الخلايا العصبية دا معزولة (الشكل 2A) ليكون من نوعية ممتازة كما أشارت إلى وجود 5.8S حادة ، و18S 28S الريباسي قمم RNA عند تحليلها على Bioanalyzer 2100 اجيلنت (اجيلنت تكنولوجيز ، وشركة () الشكل 2B). مع بداية 30-40 اليرقات طور مرحلي الثالثة تمت نحن قادرون على عزل الخلايا العصبية في المتوسط ​​300-500 دا الطبقة الرابعة باستخدام برنامج تشغيل PPK - GAL4 ، والخلايا العصبية دا 1500-2000 (الدرجة الأولى والثاني والثالث والرابع) باستخدام عموم دا الخلايا العصبية الخاصة GAL4 21-7 السائق. لتقييم تخصيب العصبية معينة من خلايا منعزلة لدينا أجرينا PCR الكمي عكس النسخ (qRT - PCR) باستخدام اثنين من الجينات المحددة علامات العصبية (elav وfutsch). وكشفت هذه التحليلات تخصيب أضعاف كبير من الجينات مما يدل على أن كل من علامة محددة للغاية لتخصيب الخلايا العصبية دا بالمقارنة مع التدفق من خلال استخدام بروتوكول لدينا (الشكل 3). أخيرا ، تم استخدام الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا العصبية القومية على حد سواء ودا الطبقة الرابعة لأداء الخلايا العصبية دا الترانسكربتي التنميط التعبير على melanogaster ذبابة الفاكهة بنسبة ضئيلة اجيلنت ميكروأرس كامل الجينوم (4 × 44K) (الشكل 4). حددت هذه التحليلات العديدة المنظمين المتورطين سابقا التشكل دا تغصن الخلايا العصبية ، بالإضافة إلى مجموعة واسعة من الجزيئات uncharacterized المفترضة سابقا ومسارات نقل الإشارة التي تلعب أدوارا وظيفية هامة محتملة في مجال التنمية عصبون دا. الدراسات الرامية إلى تقييم الدور المحتمل (ق) من هذه الجزيئات uncharacterized سابقا في التوسط دا عصبون التنمية ، والتشكل تغصن تحديدا ، ويجري في الوقت الحاضر.


يتم تشريح تخطيطي الفرز المغناطيسي حبة من الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة (أ) العمر المتطابقة اليرقات طور مرحلي third تحمل الخلايا العصبية الخاصة دا GAL4 ، UAS - mCD8 - GFP التحوير مراسل بواسطة قلب إهاب اليرقات من الداخل إلى الخارج ، لفضح : الشكل 1. PNS العازلة لتفارق وتخزينها في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة (ب) أن يتم تفارق الأنزيمية بها مضيفا Blendzyme Liberase 3 من محلول يحتوي على بشرة اليرقات (ج) وكذلك الأنسجة اليرقات فصلها عن مزيج من سحن ، وvortexing douncing لإزالة أنسجة غير محدد المسمى مثل الدهون الهيئات والأمعاء والجهاز العصبي المركزي (د ، ه) يتم تصفيتها ثم الخلايا باستخدام خلية 30 ميكرون التصفية. الحل يحتوي على تعليق خلية واحدة من أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك العضلات ، وخلايا عصبية ظهائر (و) لمكافحة فأر CD8a الضد المغلفة Dynabeads M - 280 تضاف الى تعليق الخلية ، وحضنت على الثلج لمدة 30-60 دقيقة ( ز) والخرز المغناطيسي بربط الخلايا العصبية التي هي التعبير عن دا ماوس CD8 الموسومة GFP انصهار بروتين (ح ، ط) يتم فصل الخلايا المغلفة حبة المغناطيسي عن طريق وضع حل في حقل مغناطيسي قوي. يتم تجاهل طاف ، ويتم غسل الخلايا ثلاث مرات لإزالة أي بقايا الخلايا غير محددة ، مما أدى إلى (ي) حتنقية ighly السكان من الخلايا العصبية دا. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.


الشكل 2 : (أ) صورة الممثل المختارة بشكل إيجابي ، GFP الخلايا العصبية فلوري دا الطبقة الرابعة من خلية معزولة بسبب التفكك والفرز حبة المغناطيسي. تم تحديد عدد السكان مما أدى إلى تكون الخلايا العصبية عالي التخصيب لالعصبونات دا الطبقة الرابعة مع ضئيلة أو معدومة الشوائب تلويث الخلية (ب) 2100 اجيلنت Bioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز ، وشركة) من الحمض النووي الريبي مجموع مخطط رحلاني معزولة عن حبة المغناطيسي فرز الخلايا العصبية دا ، والتي تبين نوعية ممتازة مجموع RNA كما هو مبين من خلال وجود 5.8S ، 18S ، وrRNAs 28S. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.


الشكل 3 : qRT - PCR تحليل العصبية علامة التعبير الجيني في الخلايا العصبية دا معزولة (GAL421 - 7 ، UAS - mCD8 - GFP) وأجري خلال تدفق الكسر في ثلاث نسخ. تم تقييم مستويات التعبير من الجينين العصبية علامة محددة (elav وfutsch) بواسطة qRT - PCR. تم تطبيع القيم التي تم الحصول عليها من هذه التحليلات لرقابة الذاتية (rp49) ، وحسبت المستويات النسبية لتلك التي لوحظت في التدفق من خلال الكسر باستخدام الأسلوب ΔΔCτ 6. وقد أثرى بشكل ملحوظ على حد سواء وelav futsch في عزل الخلايا العصبية دا السكان بالمقارنة مع تدفق من خلال الكسر.


الشكل 4 : ممثل من الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية الخاصة Cy3 المسمى ميكروأري ملف الصورة. يظهر هنا هو ذبابة الفاكهة اجيلنت melanogaster كامل الجينوم ميكروأري بنسبة ضئيلة (4 × 44K) المهجنة مع Cy3 - RNA labeld مجموع معزولة عن الخلايا العصبية دا الطبقة الرابعة يطهر الفرز حبة المغناطيسي. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هو الأمثل للبروتوكول المعروضة هنا لعزل وتنقية الخلايا العصبية المحيطية التي تتقيد باحكام على السطح الداخلي للبشرة third ذبابة الفاكهة اليرقات طور مرحلي باستخدام الفرز المغناطيسي خلية حبة الاستراتيجية. في حين أننا قد استخدمت هذا البروتوكول على وجه التحديد لعزل الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة ، وتطبيقات هذا البروتوكول إلى عزل أنواع الخلايا الأخرى التي تلتزم في إهاب اليرقات أو مراحل العذراء للتنمية يمكن (على سبيل المثال ظهائر والعضلات والأعصاب الطرفية الأخرى) التي يمكن تكييفها تفاوت عدد قليل من المعالم واستخدام GAL4 متميزة ، الجينات المحورة مراسل UAS - mCD8 - GFP التي تسمية نوع من الخلايا أو أنواع الفائدة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول في كل من فقدان الوظائف ، والنهج كسب ، من وظيفة حيث يمكن استنساخ الجينات ذات الاهتمام الى التحوير UAS - mCD8 - GFP التي يمكن أن يقترن مع التحوير GAL4 إما لتوجيه الجينات خسارة معينة من وظيفة (على سبيل المثال ، UAS رني) أو الحصول على وظيفة من بين الخلايا إلى نوع من الاهتمام. على سبيل المثال ، في حالة وجود عامل النسخ قد يرغب المرء في تحديد الجينات يحتمل أن تصل إلى أسفل أو التنظيم على فقدان وظيفة ، أو الحصول على وظيفة من بين التعبير في نوع من الخلايا في المصالح. من خلال عزل الحمض النووي الريبي مجموع من نوع من الخلايا تنقيته من الفائدة من خلال هذا البروتوكول ، واستخدام هذا الحمض النووي الريبي لأداء ميكروأري التنميط التعبير فمن الممكن لتحديد الجينات التي قد تنظم تفاضليا تمثل الأهداف النهائية للتنظيم الترانسكربتي التي تلعب دورا في التوسط المظهري التغييرات داخل الخلية .

لفرز الخلايا ناجحة لا بد من إيلاء اهتمام دقيق للخطوات الحاسمة التي أبرزت في البروتوكول أعلاه. أمثلة من المجالات المشتركة المشكلة التي قد تتطلب بعض المشاكل كذلك والتحسين ، وتبعا لنوع من الخلايا ، ما يلي : (1) العائد المنخفض والخلية (2) خلية التثاقل خلال العزلة حبة المغناطيسي. في الحالة الأولى ، يمكن للمرء أن حاول تقليل تركيز Blendzyme Liberase 3 ، وتعويض ذلك بزيادة تفارق الميكانيكية عبر douncing. في الحالة الثانية ، يمكن للمرء أن محاولة الحد من قوة المجال المغناطيسي من خلال تطبيق واحد أو عدة طبقات من الشريط اللاصق على مختبر المغناطيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الدكاترة. Yuh - ننغ جان وGrueber ويس لتوفير مخزونات الطيران المستخدمة في هذه الدراسة. الكتاب يعترف F. توماس ميلر وكيت Jeffress التذكارية الاستئماني لدعم هذه البحوث (DNC) ومكتب جامعة جورج ماسون في بروفوست (EPRI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) MP Biomedicals PBS10X02 Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3 Roche Group 11814176001 Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY Sigma-Aldrich 83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody Invitrogen MCD0815 100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V GIBCO, by Life Technologies 11018-017 Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 11205D 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions

Equipment

  • (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
  • Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
  • Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
  • 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
  • Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
  • Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
  • Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
  • Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
  • Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
  • Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
  • Vortex
  • Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  4. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  5. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
  6. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).

Comments

3 Comments

  1. Hi, I am very interested in getting more info aboout magnetic beads for separating potrein A, and info about how to scale and validate processes. Please if you know any place where I can get this info please tell me. The only valuable think I have found 'till now is this free guide, not very deep deep though, about http://sepmag.eu/the-basic-guide-to-use-biomagnetic-separation-in-production-processes-free-download magnetic bead separation production processes

    Reply
    Posted by: Paula C.
    March 24, 2013 - 1:37 PM
  2. Hi Paula, I'm Lluis M. Martinez, CSO from Sepmag. Thanks for share the guide link. This guide is 'basic' as you point. The 'advanced' version (also free) would be ready in few weeks, if you have download the 'basic' you would receive and e-mail when it would be ready. We have also published the 'Starting guide to Validate Biomagnetic Separation Processes' a http://sepmag.eu/the-starting-guide-to-validate-biomagnetic-separation-processes/. The 'advanced' guide on the subjet guide is also offered free to who download the 'starting' one. We are tryng to share our experience with solving issues magnetic beads-based IVD manufacturing processes (some of our systems are working with 10 litres batches). Please feel free to contact me through the sepmag website contact form and I may provide some specfic references for your questions.

    Reply
    Posted by: Lluis M. M.
    March 25, 2013 - 10:49 PM
  3. Thank you very much Lluis, this guide has been very helpful.

    Reply
    Posted by: Paula C.
    March 28, 2013 - 2:40 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics