6.5 डीपीसी माउस भ्रूण के विच्छेदन

Biology

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Summary

Postimplantation चरण भ्रूण के अलगाव एक जीन patterning के अध्ययन करने के लिए और सेल वंश भ्रूण विकास के दौरान निर्णय लेने की प्रक्रियाओं का विश्लेषण की अनुमति देता है, लेकिन जल्दी भ्रूण के उचित विच्छेदन चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इस प्रोटोकॉल जल्दी आदिम लकीर - चरण भ्रूण अलग के लिए एक विधि का वर्णन (~ 6.5 दिनों के बाद coitum [डीपीसी]).

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Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

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Abstract

स्तनधारी भ्रूण के विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण जीन समारोह, सेल सेल बातचीत और संकेतन कि गाइड भ्रूण patterning तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, माउस भ्रूण के आरोपण के बाद शीघ्र ही decidua से विच्छेदन एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया हो सकता है, और कर सकते हैं, इस प्रक्रिया की विस्तृत कदम दर कदम प्रलेखन कमी है.

यहाँ हम प्रदर्शन कैसे आरोपण के बाद भ्रूण (6.5 डीपीसी) पहली बार एक गर्भवती माउस (योनि प्लग में नामित किया गया था दिन 0.5 poist coitum का पता लगाने के) के गर्भाशय विदारक और बाद में मातृ decidua से भ्रूण विदारक द्वारा अलग कर रहे हैं. रीचर्ट झिल्ली के विच्छेदन के रूप में अच्छी तरह से ectoplacental शंकु के हटाने के रूप में वर्णित है.

Protocol

एक महिला माउस से प्रजनन अंगों के विच्छेदन

  1. गर्भवती जानवरों सीओ 2 संकुचित गैस का उपयोग asphyxiation द्वारा euthanized हैं .
  2. शोषक पैड पर पशु लापरवाह लेटाओ और यह 70% इथेनॉल में लेना माउस बालों के साथ विच्छेदन contaminating के जोखिम को कम.
  3. त्वचा पिंच और नियमित रूप से शल्य कैंची से midline पर एक छोटे पार्श्व चीरा बनाते हैं. मजबूती से ऊपर और चीरा नीचे त्वचा को पकड़ो और त्वचा सिर और पेट बेनकाब पूंछ की ओर अलग खींच.
  4. संदंश के साथ पेरिटोनियम समझ और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए कटौती.
  5. दो गर्भाशय सींग, oviduct और अंडाशय: शरीर गुहा के पृष्ठीय क्षेत्र में प्रजनन अंगों का पता लगाएँ.

आदिम स्ट्रीक मंच विच्छेदन (6.5 डीपीसी)

  1. Oviduct नीचे गर्भाशय लोभी द्वारा गर्भाशय सींग निकालें और यह mesometrium के साथ मुफ्त में कटौती. बर्फ के ठंडे पीबीएस में dissected गर्भाशय प्लेस.

    चित्रा 1

    चित्रा 1

  2. प्रत्येक भ्रूण गर्भाशय सींग के साथ आरोपण साइटों के बीच काटने से अलग करें.

    चित्रा 2

    चित्रा 2


  3. आसपास के मांसपेशी परत और छा decidua ऊतक के बीच घड़ीसाज़ संदंश फिसलने से पेशी गर्भाशय अस्तर मुट्ठी. वापस मांसपेशी परत छील, decidua उजागर.

    चित्रा 3

    चित्रा 3

  4. (लगभग 1 / 5) decidua ऊतक के सुप्रीम जो संलग्न भ्रूण के midventral या बाहर का टिप का खुलासा होगा उजागर decidua के एक हिस्से का क्लिप.

    चित्रा 4

    चित्रा 4

  5. भ्रूण बाहर खोलीदार संदंश के सुझावों का उपयोग किया जा सकता है. पियर्स भ्रूण आसपास संदंश और खुले संदंश के साथ decidua decidua फाड़.

    चित्रा 5

    चित्रा 5

  6. एक बार भ्रूण निकाल दिया जाता है, Reichart झिल्ली अभी भी ectoplacental शंकु (ट्रोफोब्लास्ट) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है संलग्न किया जाना है. भ्रूण सावधान विच्छेदन से आगे विच्छेदित कर सकते हैं.

    चित्रा 6
    चित्रा 6

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Discussion

माउस में Postimplantation 4.5 डीपीसी और जन्म के बीच होता है. यह विच्छेदन पद्धति लागू किया जा सकता है अनिवार्य रूप से के रूप में वर्णित है, पहले या बाद में 5.5-8.5 डीपीसी पर मंच भ्रूण को अलग.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

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References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

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