Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Biology

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Summary

Isolation der Einnistung-Embryonen erlaubt es, Gen-Mustern zu studieren und zu analysieren Zell-Linie Entscheidungsprozesse während der embryonalen Entwicklung, aber richtigen Zergliederung des frühen Embryos kann schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Anfang primitive-Streifen-Embryonen (~ 6,5 Tage post coitum [DPC]).

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Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

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Abstract

Die Analyse der Genexpression während der frühen Stadien der embryonalen Entwicklung von Säugetieren kann wichtige Hinweise auf die Funktion von Genen, Zell-Zell-Interaktion und Signalisierung Mechanismen, die Führung embryonalen Musterbildung. Allerdings kann Dissektion der Maus-Embryo aus der Dezidua kurz nach der Implantation eine herausfordernde Prozedur sein, und detaillierte Schritt-für-Schritt-Dokumentation dieses Prozesses fehlt.

Hier zeigen wir, wie nach der Implantation (6,5 DPC) Embryonen, indem Sie zuerst Sezieren der Gebärmutter einer schwangeren Maus (Erkennung des vaginalen Stecker wurde als Tag 0,5 Poist coitum) und anschließend seziert der Embryo vom mütterlichen Dezidua isoliert sind. Die Zerlegung der Reichert-Membran ist ebenso wie die Entfernung der ectoplacental Kegel beschrieben.

Protocol

Dissection der Geschlechtsorgane aus einer weiblichen Maus

  1. Trächtige Tiere werden durch CO 2 Ersticken mit Druckgas eingeschläfert.
  2. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf saugfähige Unterlage und legen Sie ihn in 70% Ethanol, um das Risiko einer Kontamination der Präparation mit Maus Haare zu reduzieren.
  3. Pinch die Haut und machen Sie einen kleinen seitlichen Einschnitt an der Mittellinie mit regelmäßigen chirurgische Scheren. Halten Sie die Haut fest oberhalb und unterhalb des Schnittes und ziehen die Haut auseinander auf den Kopf und Schwanz auf den Bauch freizulegen.
  4. Fassen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und schneiden in die Bauchhöhle aussetzen.
  5. Suchen Sie die Fortpflanzungsorgane im dorsalen Bereich der Leibeshöhle: zwei Uterushörner, der Eileiter und der Eierstöcke.

Primitive Streak-Bühne (6,5 DPC) Dissection

  1. Entfernen Sie die Uterushorn durch Ergreifen der Gebärmutter unter der Eileiter und schneiden Sie es kostenlos an der Mesometrium. Legen Sie seziert Gebärmutter in eiskaltem PBS.

    Abbildung 1

    Abbildung 1

  2. Trennen Sie die einzelnen Embryo, indem zwischen Nidationsstellen entlang Uterushorn.

    Abbildung 2

    Abbildung 2


  3. Fassen Sie den muskulösen Gebärmutterschleimhaut, indem Uhrmacher-Pinzette zwischen den umgebenden Muskulatur und hüllte decidua Gewebe. Ziehen Sie die Muskelschicht, Freilegung der decidua.

    Abbildung 3

    Abbildung 3

  4. Clip aus einem Teil der exponierten decidua an der Spitze (ca. 1 / 5 der Dezidua Gewebe), die die midventral oder distalen Spitze des geschlossenen Embryo ausgesetzt wird.

    Abbildung 4

    Abbildung 4

  5. Der Embryo kann berappt mit den Spitzen der Pinzette. Pierce der Dezidua mit einer Pinzette um den Embryo und offenen Pinzette decidua zerreißen.

    Abbildung 5

    Abbildung 5

  6. Sobald Embryo entfernt wird, kann Reichart-Membran noch ebenso wie die ectoplacental Kegel (Trophoblast) angebracht werden. Der Embryo kann durch sorgfältige Präparation seziert werden.

    Abbildung 6
    Abbildung 6

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Discussion

Einnistung in der Maus tritt zwischen 4,5 DPC und Geburt. Diese Zerlegung Verfahren kann angewendet werden, im wesentlichen wie beschrieben, werden früher oder später zu isolieren Embryonen bei 5,5-8,5 dpc.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

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References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

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