Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isolamento di post-impianto di embrioni allo stadio permette di studiare e analizzare patterning gene cellulari lignaggio processi decisionali durante lo sviluppo embrionale, ma corretta dissezione dell'embrione precoce può essere difficile. Questo protocollo descrive un metodo per isolare primi primitivo-striscia-stadio embrioni (~ 6,5 giorni post coitum [dpc]).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analisi dei modelli di espressione genica durante le prime fasi di sviluppo embrionale dei mammiferi in grado di fornire importanti indizi circa la funzione del gene, l'interazione cellula-cellula e meccanismi di segnalazione che patterning guida embrionale. Tuttavia, la dissezione dell'embrione mouse dal decidua poco dopo l'impianto può essere un procedimento impegnativo e dettagliato passo-passo la documentazione di questo processo è carente.

Qui mostriamo come post-impianto (6,5 DPC) sono isolate da embrioni prima dissezione nell'utero di un topo gravide (rilevamento del tappo vaginale è stato designato giorni 0,5 coitum poist) e poi sezionare l'embrione da decidua materna. La dissezione della membrana Reichert è descritto così come la rimozione del cono ectoplacental.

Protocol

Dissezione di organi riproduttivi di un topo femmina

  1. Animali gravidi sono eutanasia da CO 2 asfissia con gas compresso.
  2. L'animale giaceva supino sul tampone assorbente e immergerlo in etanolo al 70% per ridurre il rischio di contaminare la dissezione con i capelli del mouse.
  3. Pizzicare la pelle e fare una piccola incisione laterale alla linea mediana con regolare forbici chirurgiche. Tenere la pelle saldamente sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle a parte verso la testa e la coda per esporre l'addome.
  4. Afferrare il peritoneo con una pinza e taglio per esporre la cavità addominale.
  5. Individuare gli organi riproduttivi nella regione dorsale della cavità del corpo: due corna uterine, l'ovidotto e le ovaie.

Primitivo Streak stadi (6,5 DPC) Dissection

  1. Rimuovere il corno uterino afferrando l'utero al di sotto del ovidotto e tagliarlo libero lungo il mesometrium. Luogo utero sezionato in ghiaccio PBS freddo.

    Figura 1

    Figura 1

  2. Separare ogni embrione, tagliando tra siti d'impianto lungo corno uterino.

    Figura 2

    Figura 2


  3. Afferrare il rivestimento uterino muscolare facendo scorrere orologiaio pinza tra lo strato muscolare e il tessuto circostante decidua avvolto. Staccare lo strato muscolare, esponendo il decidua.

    Figura 3

    Figura 3

  4. Clip di una porzione della decidua esposti al vertice (circa 1 / 5 del tessuto decidua), che esporrà la punta midventral o distale dell'embrione racchiuso.

    Figura 4

    Figura 4

  5. L'embrione può essere sborsato con le punte delle pinze. Pierce decidua con una pinza che circonda l'embrione e pinze aperto a strappare decidua a parte.

    Figura 5

    Figura 5

  6. Una volta embrione viene rimosso, membrana Reichart può essere ancora attaccato così come il cono ectoplacental (trofoblasto). L'embrione può essere ulteriormente sezionato da dissezione accurata.

    Figura 6
    Figura 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Post-impianto nel topo si verifica tra 4,5 dpc e la nascita. Questo metodo può essere applicato dissezione, essenzialmente come descritto, per isolare prima o dopo gli embrioni scena al 5,5-8,5 dpc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics