La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Biology

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Summary

El aislamiento de embriones etapa post-implantación, permite estudiar los patrones de genes y analizar células de linaje toma de decisiones durante el desarrollo embrionario, aunque la disección adecuada del embrión temprano puede ser un desafío. Este protocolo describe un método para aislar las primeras etapas primitivas racha de embriones (~ 6,5 días post coitum [dpc]).

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Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

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Abstract

Análisis de patrones de expresión génica durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de mamíferos pueden proporcionar pistas importantes sobre la función del gen, la célula-célula la interacción y los mecanismos de señalización que guía los patrones embrionarias. Sin embargo, la disección del embrión de ratón de la decidua, poco después de la implantación puede ser un procedimiento difícil y detalladas paso a paso la documentación de este proceso es insuficiente.

Aquí se demuestra cómo después de la implantación (6,5 dpc), los embriones se encuentran aisladas por primera disección del útero de un ratón embarazadas (detección de coitum el tapón vaginal fue designado poist días 0,5) y, posteriormente, la disección del embrión a partir de la decidua materna. La disección de la membrana de Reichert se describe así como la eliminación del cono ectoplacental.

Protocol

La disección de los órganos reproductores de una hembra de ratón

  1. Los animales en gestación son sacrificados por asfixia de CO 2 de gas comprimido.
  2. Coloque el animal en decúbito supino almohadilla absorbente y sumergirlo en etanol al 70% para reducir el riesgo de contaminación de la disección con el pelo del ratón.
  3. Pellizcar la piel y hacer una pequeña incisión lateral en la línea media con regulares tijeras quirúrgicas. Mantener la piel firme por encima y por debajo de la incisión de la piel y tirar hacia fuera de la cabeza y la cola para exponer el abdomen.
  4. Sujete el peritoneo con una pinza y se corta a exponer la cavidad abdominal.
  5. Localizar los órganos reproductivos en la región dorsal de la cavidad del cuerpo: dos cuernos uterinos, el oviducto y los ovarios.

Raya primitiva etapa (6,5 dpc) Disección

  1. Quitar el cuerno uterino, tome el útero por debajo del oviducto y cortar libre a lo largo del mesometrio. Lugar útero disecados en PBS enfriado con hielo.

    Figura 1

    Figura 1

  2. Separe cada embrión, por el corte entre los lugares de implantación a lo largo de los cuernos uterinos.

    Figura 2

    Figura 2


  3. Sujete el revestimiento del útero muscular deslizando pinzas de relojero entre la capa muscular y el tejido circundante decidua envuelto. Pele la capa muscular, la exposición de la decidua.

    Figura 3

    Figura 3

  4. Clip de una porción de la decidua expuestos en el vértice (aproximadamente 1 / 5 de los tejidos decidua), que expondrá la punta midventral o distal del embrión encerrado.

    Figura 4

    Figura 4

  5. El embrión puede ser bombardeado a cabo utilizando las puntas de unas pinzas. Pierce la decidua con unas pinzas que rodea al embrión y pinzas abiertas al desgarro decidua aparte.

    Figura 5

    Figura 5

  6. Una vez que se extrae de embriones, la membrana Reichart todavía puede estar unido, así como el cono ectoplacental (trofoblasto). El embrión puede ser diseccionado más de una cuidadosa disección.

    Figura 6
    Figura 6

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Discussion

Post-implantación en el ratón produce entre 4,5 dpc y el parto. Este método de disección puede ser aplicado, esencialmente como se describe, para aislar antes o después de los embriones en etapa de 5.5-8.5 DPC.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

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References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

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