גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

Published 2/25/2007
8 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

Cite this Article

Copy Citation

McKinney-Freeman, S., Daley, G. Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (2), e162, doi:10.3791/162 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תא גזע מוגדר בתא עם היכולת הן עצמית לחדש וליצור בידול צאצאים מרובים. לתאי גזע עובריים (ESC) נגזרות הבלסטוציסט העובר מוקדם הם pluripotent ביכולת differentiative. פוטנציאל עצום differentiative שלהם הפכה אותם למוקד של מחקר רב התרכזו והסיק איך לפתות אותם כדי לייצר תאים מסוגים שימושי קלינית. גזרה מוצלחת של בתאי גזע hematopoietic (HSC) מהעכבר ESC לאחרונה הושג וניתן דמיינו בפרוטוקול הווידאו הזאת. HSC, ניתן לטעון את האוכלוסייה תא ביותר לנצל קלינית, משמשות לטיפול מספר עצום של ממאירויות והפרעות hematopoietic. עם זאת, חולים רבים שעשויים להפיק תועלת מטיפול HSC חוסר גישה תורמים מתאימים. ESC יכול לספק מקור חלופי של HSC עבור חולים אלו. פרוטוקול הבאה קובעת הבסיס שממנו ESC-HSC ניתן ללמוד ולהודיע ​​המאמצים לבודד HSC מ ESC האדם. בפרוטוקול זה, ESC הם להבדיל גופים embryoid (EBS) במשך 6 ימים בידול זמינים מסחרית מראש לגילוי נסיוב hematopoietic אופטימלית. EBS הם ניתק אז נגוע HoxB4 retroviral. אינפקטד EB-derived תאים מצופה על OP9 stroma, מח עצם קו סטרומה תא נגזר מכסה הגולגולת של M-CSF-/ - עכברים, ושיתוף בתרבית בנוכחות hematopoiesis קידום ציטוקינים למשך עשרה ימים. במהלך תרבות משותפת זו, תאים נגועים להרחיב באופן משמעותי, וכתוצאה מכך הדור בריכה הטרוגנית של 100s של מיליוני תאים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי עכברים הצלה מחדש מוקרן קטלנית.

Protocol

התמיינות של תאים עובריים

  1. איסוף בקבוקון ומחוברות ליד של תאים עובריים (ESC) דרך הטיפול עם טריפסין ESC.
  2. Resuspend תאים 5 מ"ל של התקשורת גזירה להעביר שאינו מצופה ג'לטין T25 לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. אחזר supernatant לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה.

    הערה: fibroblasts עכבר עובריים (MEFs) מן התרבויות ESC לצרף בקלות הלא מצופה ג'לטין T25 ובכך מתרוקנים מתרבות במהלך שלב זה ציפוי. אם אתה לא culturing ESC על MEFs, אתה יכול לדלג על צלחת מראש.

  3. Resuspend-MEF מדולדל ESC בתקשורת בידול בכל מ"ל cells/50 333,333. ריכוז התוצאה ESC/15 100 מ"ל.
  4. שימוש רב ערוצי pipettor, צלחת ESC על ירידה cells/15 100 מ"ל ב -15 ס"מ 2 צלחות פטרי. Pipettor עם 8 ערוצים, אתה אמור להיות מסוגל להתאים על 18-22 שורות של טיפות לכל צלחת (כ 5 מ"ל לכל צלחת).

    הערה: לקבלת הפרוטוקול הזה, 2-5 15 ס"מ 2 מנות של טיפות יהיה יותר מהדרוש ויש תשואה 2-5 x 10 6 ששת הימים EB-derived תאים.

  5. בעדינות להעיף צלחות כדי להפוך טיפות. לדגור על 37 ° C 5% CO 2 למשך 48 שעות.
  6. בריכת טיפות ידי בעדינות מתערבל צלחות להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף צלחות עם 4-6 מ"ל של PBS ולהוסיף אותו 15 מ"ל חרוטי.

    הערה: ייתכן הבריכה עד חמש צלחות ירידה תלוי. EBS יגדל כפי שהם ממשיכים להבדיל אם הם מרוכזים מדי והם נוטים ליצור גושים גדולים.

  7. אפשר EBS ונקווה להתיישב על ידי כוח הכבידה (כ -10 דקות). לשאוב supernatant מבלי להפריע EBS. Resuspend בעדינות 10 מ"ל בידול התקשורת והעברת עד 10 צלחת לא חסיד ס"מ פטרי.
  8. מניחים צלחת על צלחת פטרי שייקר בסל"ד 50 ו לדגור על 37 ° C 5% CO 2.
  9. 24 שעות לאחר מכן (יום ארבעה בידול), צלחות מערבולת להתרכז EBS במרכז של צלחת פטרי. בזהירות להחליף 50% לתקשורת (5 מ"ל) עם 5 מ"ל מדיה בידול טריים. חזור אל צלחת החממה במשך יומיים נוספים.

EB דיסוציאציה וזיהום עם MSCV-HoxB4-IRES-GFP

  1. ביום שישה בידול, העברת EBS על צינור 15 מ"ל חרוטי. אפשר להתיישב על ידי כוח הכבידה.
  2. לשאוב מדיה resuspend ב 10 מ"ל PBS. EBS אפשר ליישב על ידי כוח הכבידה. לשאוב PBS.
  3. מוסיפים 250 מ"ל לערבב דיסוציאציה האנזים 1 מ"ל PBS. דגירה באמבט מים C ° 37 במשך 20 דקות, לפעמים מתערבל צינור לערבב אנזימים EBS.
  4. הוסף חוצץ 8 מ"ל אנזים ללא ניתוק.
  5. Triturate התערובת בעזרת פיפטה 5 מ"ל עד EBS הם מנותקים לחלוטין (בערך 10 פעמים; pipetting מופרז תגדיל את מותו בתוך בהכנת-EB נגזר התא).
    1. תערובת יהיה מעונן עם תאים כמו EBS לנתק.
    2. הנחת קצה פיפטה נגד התחתון של צינור חרוטי במהלך טחינה דקה תיצור כוח גזירה כי יהיה מאוד להקל על ניתוק.
  6. איסוף תאים באמצעות צנטריפוגה.
  7. Resuspend EB-derived תאים 5 מ"ל של IMDM 10% מהסכום באמצעות הרחקה trypan כחול

    הערה: בין יום לארבעה ימים שישה בידול, EBS למער שתוצאתה כמות גדולה של אפופטוזיס ו death.Thus התא, ביום השישי, למעלה מ -30% EB-derived תאים עשויים כתם כחול עם trypan.

  8. תאים Resuspend EB-נגזרת ב 100,000 תאים / 2 מ"ל של 10% + IMDM ויראלי supernatant כזה משרד הפנים של 50-10 הוא achieved.Add סולפט protamine לריכוז סופי של 8 מ"ג / מ"ל.

    הערה: הכן EB מספיק / לערבב supernatant ויראלי לצלחת ארבע צלחות 6-היטב (בהנחה 2 mL / טוב).

  9. פלייט 2 מ"ל EB / לערבב היטב לכל supernatant ויראלי של ארבע 6 צלחות היטב מראש מצופה OP9 תאים stroma (ראה להלן).
  10. צנטריפוגה צלחות ב 2500 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. העברת צלחות החממה ב 37 ° C 5% CO 2.
  11. 4-6 שעות לאחר מכן, מסיק supernatant מתוך צלחות לאסוף את כל התאים הנותרים פוטנציאל ההשעיה באמצעות צנטריפוגה.
  12. Resuspend גלולה (עשוי להיות קטן) ב IMDM מ"ל 48 10% + ציטוקינים. לוותר על 2 מ"ל / היטב resuspension המקורי four-6 גם צלחות שבו זיהום בוצע supernatant נאסף.

    הערה: תמיד להכין 10% IMDM + ציטוקינים טרי בזמן השימוש.

  13. דגירה צלחות ב 37 ° C 5% CO 2 למשך שבעה ימים. מושבות צריכה להיות ברורה על ידי זיהום four שלאחר יום גדול בנוי היטב על ידי שבעה ימים. הרחבת חזקים צריכים להניב 40-60 מושבות / גם ביום שבע.
  14. על שבעה זיהום שלאחר יום, לאסוף בריכת כל התאים (כולל OP9 stroma) מבארות כל ידי טיפול עם טריפסין.

    הערה: אין להשליך supernatant או PBS שוטף המועסקים במהלך טריפסין treatment.At הנקודה הזו בתרבות, מושבות מסוימים עשויים להיות חסיד רק באופן רופף ויש תאים רבים floaהטבעת suspension.Collect ובריכת כל מתרחץ supernatant על מנת להבטיח כי לא התאים ערך פוטנציאלי מבוטלים.

  15. תאים Resuspend ב IMDM 8 מ"ל טרי 10% + ציטוקינים. הפץ 2 MLS / בקבוקון לארבע צלוחיות T75. הוסף נוספת 13 MLS 10% + ציטוקינים IMDM אל בקבוק אחד. לדגור על 37 ° C 5% CO 2 למשך שלושה ימים (סה"כ עשרה ימים של זיהום הודעה).

התרבות ציפוי של OP9 stroma

  1. שמור OP9 stroma פי פרוטוקולים סטנדרטיים ב 20%, ממ. OP9 התאים יהיה לשנות את מאפייני כאשר גדלה confluency לפצל תמיד ב 80% confluency על הפיצול לא יותר מ 01:03.
  2. 24 שעות לפני ההדבקה של שישה יום EB-derived תאים עם MSCV-HoxB4-IRES-GFP, צלחת 25,000 OP9 תאים / טוב של ארבעה 6 צלחות גם 20% מ-.

, אוסף חלוקה והשתלות

  1. איסוף תאים מורחבת על stroma OP9 עשרה ימים באמצעות טיפול עם טריפסין. ספירת תאים.

    הערה: אין להשליך supernatant או PBS שוטף המועסקים במהלך הטיפול טריפסין. בשלב זה בתרבות, מושבות מסוימים עשויים להיות חסיד רק באופן רופף ויש תאים רבים צפים suspension.Collect ובריכת כל מתרחץ supernatant על ​​מנת להבטיח כי לא התאים ערך פוטנציאלי מבוטלים.

    הערה: הרחבה טוב צריך התשואות בין 40-50 x 10 6 תאים / צלחת המקורי 6-גם נגוע, עבור סכום כולל של 160-200 x 10 6 תאים.

  2. תאים עשויים להיות מופרדים באמצעות מבחר חרוז או FACS מגנטי על פי טכניקות סטנדרטיות בשלב זה בפרוטוקול.
  3. להשתלה, לספק תאים באמצעות רטרו מסלולית או הזרקה לווריד הזנב לנמענים לקוי Rag-2/gc (במשקל בין 15-22 גרם) נתון מנה פיצול של 9.25 gy של 2.5 שעות הקרנה. בנפרד.

    הערה: זה קריטי, כי המשקל של בעלי החיים ליפול בין 15-22 גרם בזמן של קרינה. אם הם גדולים יותר מאשר 22 גרם, 9.25 gy לא יהיה מנה מספקת של הקרנה, כדי להבטיח את אבלציה המתאימים תאים לא יכול לתווך להציל הקרנה קטלנית ו / או נקלטים תא hematopoietic. אם השתלת בעלי חיים גדולים יותר, במינון קרינה המתאים צריכה להיקבע באופן ניסיוני.

  4. מינון מינימלי של 2-5 x 10 6 תאים / החי נדרשת ערבות להציל הקרנה קטלנית. אם fractionating התאים, להזריק 2-5 x 10 6 ושווי התא (לדוגמא, אם האוכלוסייה עניין מייצג 10% בריכת unfractionated של תאים, להזריק 2-5 x 10 5 תאים / בעלי חיים).

    הערה: אם הזרקת> 2 x 10 6 תאים, תמיד מזריקים דרך וריד הזנב, כדי למנוע היווצרות תפלצת במסלול, אשר עלול לגרום כאשר מספר רב של תאים מועברות בסגנון רטרו orbitally.

  5. שמור על סמרטוט-2 - / - / GC - / - מקבלי לקוי בכלובים autoclaved בהתאם "ניקיון" של המתקן החי, השתלת פוסט חיות עשויים לדרוש הממשל מים acidified או Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) במשך 5 שבועות לאחר קרינה קטלנית.
  6. צפו> GFP 90% + ES-derived לויקוציטים בדם ההיקפי בבית 3 שבועות לאחר ההשתלה. Engraftment צריך להיות רב השושלת, למרות לימפוציטים ידועים שתיקה retroviral HoxB4-IRES-GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice Animal Taconic Farm
Plate shaker Tool VWR international 33998-360 Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor Tool VWR international 15000-174 ePet by BioHit
ES trypsin Reagent Invitrogen 15090-046 0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin Reagent Invitrogen 25300-062 0.05% Trypsin-EDTA
PBS Buffer Invitrogen 20012-027
Enzyme-free dissociation buffer Buffer Invitrogen 13151-014
Dissociation enzyme mix Buffer Invitrogen 17104-019 500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase Reagent Sigma-Aldrich H2126 freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse Reagent Sigma-Aldrich D4527
DMEM Invitrogen 10-017CV
Protamine sulfate Reagent Sigma-Aldrich P3369 8 ug/mL
EB differentiation media medium Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM medium Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines medium Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM Please view recipe on attached Protocol.doc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

8 Comments

  1. This protocol looks very helpful for me to study the hematopoietic differentiation from ES cells. I cannot find the attached Protocol.doc for the media recipe. Could I get the media recipe? If it is possible, I would be appreciated if you send me OP9 stroma cells. Thanks. Hee-Don

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 11, 2008 - 11:45 AM
  2. The best place to acquire the OP9 cells is from ATCC themselves - they have the earliest available passages of this cell line.   Please email me directly for media recipe:  shannon.mckinney@childrens.harvard.edu - I cannot see a way to upload the file with it on this post   Shannon

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 11, 2008 - 5:19 PM
  3. Thanks to Shannon for sharing her knowledge and experience with us. This is a ver detailed and amazing video. Y. Seval

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 5:18 AM
  4. Did this protocol work for EB formation from iPPS?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 22, 2009 - 4:18 PM
  5. Yes, it dŒs work for iPS cells.  Please see the following reference:  Science. ²007 Dec ²1;318(5858):19²0-3. Epub ²007 Dec 6.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 11:58 AM
  6. I was very interested in this approach. Could this be combined with other genes ie MLL fusions or signal transducers. Could you make available to me the vector as wellas the HOXB4 plasmid?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 1:33 PM
  7. Send an email to the Daley Lab website to request reagents, please

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 8:44 AM
  8. which is the media that do you use for EBs and co-culture on op9 cells?

    thanks very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2011 - 7:06 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats